車勇軍，連 蕾，侯 鈺，曹海波

邯鄲市中心醫(yī)院：1.普通外科；2.耳鼻咽喉頭頸外科，河北邯鄲 056001

橋本甲狀腺炎(HT)是一種自身免疫性甲狀腺炎，又稱慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎；甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種惡性程度較低的甲狀腺腫瘤，約占甲狀腺癌的85%，其發(fā)生會受到激素、遺傳、環(huán)境等因素的影響[1]。HT和PTC之間的關(guān)系是一個有爭議的問題，HT也可能導(dǎo)致PTC的出現(xiàn)，但目前尚無定論，其病理過程和機(jī)制尚不清楚，因此探討其分子機(jī)制尤為重要[2]。微小RNA(miRNA)是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子，長度為20～24個核苷酸，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[3]。臨床上miRNA可以作為區(qū)分單純HT與HT合并PTC的獨(dú)立分子標(biāo)志物[4]。有研究表明miR-637可能受到LncRNA HOTTIP調(diào)控，在PTC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移過程中發(fā)揮重要作用[5]，也有研究表明miR-637/HEMGN軸可以受到Circ PSD3調(diào)控促進(jìn)PTC的進(jìn)展[6]。一項(xiàng)對107例PTC患者的研究表明，MMP家族關(guān)鍵蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和Caspase家族關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)與預(yù)后具有顯著的相關(guān)性[7]，細(xì)胞學(xué)研究表明甲狀腺癌細(xì)胞中PLGF的過表達(dá)增加了基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)，而抑制PLGF的表達(dá)降低了MMP9的表達(dá)，以上均提示出MMP家族蛋白是甲狀腺癌重要的調(diào)控因子，探討MMP家族與miRNA的調(diào)控關(guān)系有助于臨床對HT和PTC機(jī)制的認(rèn)識[8]。因此，本研究將探討HT合并PTC患者穿刺組織標(biāo)本中miR-637的水平相較于單純HT患者是否有差異，通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探討miR-637對甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，并通過MMP家族蛋白檢測分析其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2019年6月至2021年6月于本院治療的92例HT患者的甲狀腺組織穿刺標(biāo)本，其中單純HT患者46例(單純HT組)，HT合并PTC患者46例(HT合并PTC組)。兩組患者年齡、性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為HT或HT合并PTC；(2)無頭頸部放射治療史；(3)癌癥無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(4)臨床資料詳細(xì)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他全身性疾病。本研究中所有患者均簽署知情同意書并通過本院倫理委員會審核。收集上述患者的甲狀腺/甲狀腺癌組織穿刺標(biāo)本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。人甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2儀器與試劑 高糖培養(yǎng)基DMEM購于美國corning公司，胎牛血清和青鏈霉素購于澳大利亞Ausbian公司；10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、50 mL離心管、15 mL離心管購于美國Corning公司；miR-637質(zhì)粒及陰性對照(NC)質(zhì)粒等購于廣州Ribobio公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CCK8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶公司；實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)儀購于瑞士羅氏公司，Western blot電泳儀購于美國Bio-rad公司。

1.3方法

1.3.1qPCR檢測組織穿刺標(biāo)本中的miR-637水平 將組織穿刺標(biāo)本在液氮中進(jìn)行研磨，采用miRNA cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA，采用SYBR Green PCR Master Mix Kit進(jìn)行miR-637的qPCR檢測，所有操作在冰上進(jìn)行并避免RNA酶污染。使用7500 Fast系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，檢測條件設(shè)置：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃20 s，40個循環(huán)。miR-637正向引物為5′-ACTGGGGGCTTTCGGGCTCTGCGT-3′，U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATA-3′，反向引物均為通用引物，使用U6作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算miR-637相對表達(dá)水平。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 TPC-1培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL)，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2，37 ℃靜置培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用胰酶消化細(xì)胞后重選，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒Lipo3000(Invitrogen公司)說明將NC質(zhì)粒和miR-637質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8 h后，更換為完全培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，48 h后分別作為NC組和miR-637組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[8]。未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組。

1.3.3CCK8法檢測細(xì)胞株TPC-1的細(xì)胞活力 嚴(yán)格按照CCK8檢測試劑盒(北京索萊寶公司)說明書進(jìn)行操作：對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞以2×103的密度接種到96孔板中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，向每孔加入10 μL CCK8溶液，此過程避免孔中生成氣泡[氣泡會影響吸光度(A)的讀數(shù)]，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的A值。

1.3.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將各組狀態(tài)良好的TPC-1細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整為1×106個/mL，接種到6孔板，24 h后用10 μmL槍頭垂直劃痕，劃痕后用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕清洗細(xì)胞2～3次，去除劃痕后漂浮的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后拍照(放大倍數(shù)為200倍)。

1.3.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將各組狀態(tài)良好的TPC-1細(xì)胞進(jìn)行消化，吹打均勻，調(diào)節(jié)密度104～105個/mL，吸取0.4 mL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室，下室培養(yǎng)基300 μL含10%FBS，將24孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，嚴(yán)格按照Transwell試劑盒說明(美國corning公司)染色后在顯微鏡下觀察拍照(放大倍數(shù)為200倍)，每組細(xì)胞小室中隨機(jī)選擇3個區(qū)域進(jìn)行拍照并進(jìn)行定量分析[11]。

1.3.6Western blot 檢測蛋白表達(dá) 將各組狀態(tài)良好的TPC-1細(xì)胞置于1 mL RIPA蛋白裂解液冰上提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓120 V 1.5 h，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%BSA封閉。加入特異性一抗MMP2(1∶2 000，Abcam)，MMP9(1∶10 000，Abcam)和GAPDH(1∶10 000，Abcam)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-637在單純HT組與HT合并PTC組患者甲狀腺/甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平比較 與單純HT組相比，HT合并PTC組miR-637表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見圖1。

注:與單純HT組比較，**P<0.01。

2.2miR-637對人甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1細(xì)胞活力的影響 與對照組相比，miR-637組細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)下降，具體表現(xiàn)為24、48、72 h的A值均低于同一時間對照組的A值(P<0.05)，而NC組和對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-637對人甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1細(xì)胞活力的影響值)

2.3miR-637對人甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1遷移和侵襲的影響 通過劃痕實(shí)驗(yàn)分析各組細(xì)胞遷移能力，見圖2。與對照組相比，miR-637組細(xì)胞遷移能力降低，具體表現(xiàn)為miR-637組細(xì)胞劃痕寬度寬于對照組(P<0.05)，而NC組和對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果表明與對照組相比，miR-637組細(xì)胞侵襲能力降低，具體表現(xiàn)為miR-637組細(xì)胞侵襲數(shù)少于對照組(P<0.05)，而NC組和對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：和對照組比較，*P<0.05；和NC組比較，#P<0.05。

2.4miR-637對人甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，miR-637組MMP2和MMP9蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NC組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

HT以甲狀腺特異性自身抗體為特征，是最常見的自身免疫性疾病之一[9]。雖然確切的病因尚未完全闡明，但HT與遺傳因素、環(huán)境因素和表觀遺傳之間具有相關(guān)性[10]。HT與其他組織細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系在既往研究中被提出，并涉及免疫系統(tǒng)和激素分泌水平的異常，其可能進(jìn)一步引發(fā)PTC，但仍存在爭議，需要進(jìn)一步深入研究[11]。PTC是上皮性惡性腫瘤，表現(xiàn)為濾泡細(xì)胞分化和一系列獨(dú)特的細(xì)胞核特征[12]，是最常見的甲狀腺腫瘤，總體預(yù)后較好，少數(shù)情況下它可能有囊性特征。大約10%的患者在最初表現(xiàn)時可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病，45歲以下的患者總體預(yù)后良好[13]。有研究發(fā)現(xiàn)右側(cè)氣管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(RPTLNM)、甲狀腺外延伸、包膜侵犯和多灶性等因素均是HT合并PTC的風(fēng)險因素[14]。本研究納入了92例HT患者，并以是否合并PTC為分組標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)了單純HT患者的組織穿刺標(biāo)本中miR-637水平較高，而HT合并PTC患者中，miR-637水平較低，提示miR-637可能成為一種鑒別診斷單純HT與HT合并PTC的標(biāo)志物。

miR-637是多種腫瘤、心血管等疾病的關(guān)鍵調(diào)控分子，研究表明miR-637通過靶向降解AKT1從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲,過表達(dá)miR-637會導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖受到顯著抑制并減弱細(xì)胞侵襲，而抑制miR-637表達(dá)則顯示出相反的生物學(xué)效應(yīng)[15]；也有研究指出miR-637可以抑制膽管癌細(xì)胞QBC939的增殖，其機(jī)制與干擾組織蛋白酶B(CTSB)表達(dá)有關(guān)[16];有臨床實(shí)驗(yàn)通過對86例動脈粥樣硬化患者和75例健康對照者的分析，發(fā)現(xiàn)miR-637可以作為動脈粥樣硬化患者診斷的獨(dú)立判斷指標(biāo)，在臨床診斷及對未來心血管事件的預(yù)測中具有重要意義[17]?；趍iR-637的重要功能及以上重要研究結(jié)果，本研究對臨床標(biāo)本中miR-637的表達(dá)差異進(jìn)行了機(jī)制研究，通過CCK8、侵襲等細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探討了miR-637對甲狀腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-637可以顯著地抑制甲狀腺癌細(xì)胞的活性，并且降低了其遷移能力和侵襲能力。腫瘤轉(zhuǎn)移的方式有直接蔓延和種植性轉(zhuǎn)移等方式，其過程都需要破壞腫瘤周圍的細(xì)胞組織，此過程伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員的作用[18]。研究表明MMP2 1306 C/T基因多態(tài)性可能增加前列腺癌的風(fēng)險，尤其是在亞洲人群中更加顯著[19]；而MMP9可以切割許多細(xì)胞外基質(zhì)蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，可以切割許多血漿表面蛋白質(zhì)，不僅與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成相關(guān)，還可以作為腫瘤診斷的獨(dú)立生物標(biāo)志物[20]。本研究表明miR-637轉(zhuǎn)染后可以顯著抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，從而降低細(xì)胞降解胞外基質(zhì)的能力，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，由此推測miR-637在單純HT患者穿刺組織標(biāo)本中的水平高于HT合并PTC的患者可能與臨床表征有一定的相關(guān)性，即miR-637低表達(dá)后，促進(jìn)了正常的甲狀腺細(xì)胞的異常增殖、異常遷移與侵襲，甚至導(dǎo)致其具有了癌細(xì)胞的典型特征，但這是否為HT患者合并PTC的原因還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-637在HT合并PTC患者穿刺組織標(biāo)本中低表達(dá)，可能成為臨床診斷的生物標(biāo)志物，并且miR-637可以抑制人甲狀腺癌細(xì)胞活性，降低細(xì)胞遷移能力和侵襲能力，其機(jī)制與基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)抑制相關(guān)。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量，通過主成分分析和受試者工作特征(ROC)曲線等分析探討miR-637是否可以準(zhǔn)確診斷或預(yù)測HT合并PTC，以及通過熒光報告實(shí)驗(yàn)探討miR-637是否與基質(zhì)金屬蛋白酶有靶向關(guān)系，為臨床診斷和治療提供新思路。