涂尾龍，吳華莉，黃濟(jì)，張鶯鶯，王洪洋，曹建國(guó)，衛(wèi)金良，甘葉青，唐賽勇，談?dòng)浪?

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106；3.上海市嘉定區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201800)

豬氣喘病(EP)是由豬肺炎支原體(Mhp)引起的豬呼吸系統(tǒng)慢性傳染疾病[1]，具有高傳染性、高致病率、低死亡率的特性，尤其是冬季寒冷季節(jié)，豬氣喘病發(fā)病率高，影響生豬的存活率、生長(zhǎng)速度等指標(biāo)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，影響了養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。早在1983年，Geary等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Mhp細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有致病因子，更深一步研究發(fā)現(xiàn)了Mhp致病的主要因素是細(xì)胞膜蛋白。張映等[3]于2002年研究豬肺炎霉形體及其膜致細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體的細(xì)胞膜對(duì)兔的腎細(xì)胞具有一定的毒性，更加證實(shí)了這種細(xì)胞膜蛋白的存在。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體致病因子黏附因子就是P97蛋白，其位于Mhp膜的表面，能夠特異地結(jié)合到豬呼吸道黏膜的纖毛上，引起豬氣喘病發(fā)作，在豬肺炎支原體致病中起關(guān)鍵作用。所以，本文從P97蛋白的分子結(jié)構(gòu)、免疫原性、單抗制備和疫苗等方面進(jìn)行闡述，為針對(duì)P97蛋白研制基因工程疫苗提供參考。

1 P97蛋白的分子結(jié)構(gòu)

Tajima等[5]研究發(fā)現(xiàn)，利用超薄切片技術(shù)和電子顯微鏡觀察，Mhp莢膜為20 nm，能夠使得支原體黏附在纖毛的表面，從而造成了纖毛的脫落。Zhang等[6]最早利用單克隆抗體鑒定出黏附因子P97蛋白，其位于Mhp膜的表面，能夠黏附于呼吸道黏膜的纖毛上。1997年，Hsu等[7]經(jīng)過(guò)對(duì)P97基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)P97編碼一個(gè)大小為124.9 ku的蛋白，然后其蛋白水解加工成為102.9 ku大小的蛋白，最后在聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上顯示大小為97 ku的蛋白。1998年，Hsu等[8]繼續(xù)對(duì)Mhp國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株232株的黏附因子P97基因克隆分析，發(fā)現(xiàn)P97主要功能區(qū)存在于C末端，包括含有15個(gè)重復(fù)基元(AAKPV/E)的R1區(qū)和4個(gè)重復(fù)基元(GTPNQGKKAE)的R2區(qū)。Minion等[9]利用免疫印跡技術(shù)對(duì)P97蛋白和纖毛結(jié)合的研究中發(fā)現(xiàn)，至少有8個(gè)P97蛋白R(shí)1區(qū)重復(fù)基元才能和纖毛結(jié)合，抗體識(shí)別需要至少3個(gè)重復(fù)基元。其中，P97蛋白的主要抗原決定簇區(qū)是在R1區(qū)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了Mhp的黏附能力和致病力與R1、R2重復(fù)基元數(shù)量有十分密切的相關(guān)性[10-11]。王凱等[12]在構(gòu)建豬肺炎支原體P97基因重組腺病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，P97基因由3 339個(gè)核苷酸組成，共編碼1 113個(gè)氨基酸。

2 P97蛋白的免疫原性

2003年，Shimoji等[13]利用P97 C末端構(gòu)建了ErysipelothrixrhusiopathiaeYS-19菌株，然后滴鼻免疫仔豬，發(fā)現(xiàn)仔豬肺病變數(shù)量顯著減少，但在仔豬血清中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)P97特異性抗體。這可能是因?yàn)閱我豢乖⒉荒苡泻玫拿庖咴裕荒芎芎玫乇Ｗo(hù)仔豬免疫力，需要更多的抗原或者重組蛋白抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，需要進(jìn)一步深入地對(duì)P97進(jìn)行研究。2006年，Chen等[14]構(gòu)建了重組的小鼠沙門氏菌Aroa CS332株疫苗，其攜帶了P97 R1，然后通過(guò)口服接種免疫，小鼠脾細(xì)胞能檢測(cè)到顯著的γ-干擾素，說(shuō)明誘導(dǎo)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Ogawa等[15]對(duì)前者實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步改良，通過(guò)皮下注射接種SC和口服Koganei株兩種方式免疫仔豬，效果非常顯著，能很好地保護(hù)仔豬，產(chǎn)生了特異性的IgA和IgG，也降低了仔豬肺部病變。2010年，Okamba等[16]利用P97重組缺陷腺病毒疫苗rAdP97c免疫仔豬，成功誘導(dǎo)出了兩種非常重要的P97特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。2009年，陳超等[17]利用GenBank中的232株，擴(kuò)增P97蛋白的C末端并得到了一個(gè)670 bp片段，然后克隆到pShttle-CMV載體上，構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)Pac I酶切后轉(zhuǎn)染到AD293細(xì)胞，最后將純化的重組病毒通過(guò)肌注和滴鼻的方式接種小鼠，獲得特異性IgG，產(chǎn)生特異性的體液免疫和黏膜免疫，但不產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。2010年，盧會(huì)英等[18]通過(guò)將Mhp纖毛黏附區(qū)R1和大腸埃希氏菌中不耐熱腸毒素B亞單位(具有黏膜免疫佐劑功能)進(jìn)行基因重組表達(dá)，構(gòu)建了pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1這兩個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)得到了兩個(gè)融合蛋白rLTBR1和rR1。2015年，王凱[19]采用了PCR技術(shù)擴(kuò)增Mhp毒株659的黏附因子P97，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，然后將其克隆在質(zhì)粒pacAd5CMVK-NpA上，構(gòu)建了其基因重組的腺病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然重組P97蛋白Ad-P97不能在PK15細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變，但可以在Ad-P97蛋白上感染的AD-293細(xì)胞和PK15細(xì)胞中高效表達(dá)，說(shuō)明重組蛋白Ad-P97具有良好的免疫原性，可以抑制Mhp對(duì)PK15細(xì)胞的黏附功能，可進(jìn)一步誘導(dǎo)仔豬免疫基因組疫苗后產(chǎn)生Mhp凝集抗體。2020年，徐嫚[20]運(yùn)用相關(guān)信息軟件技術(shù)，在Mhp183基因上篩選出一段大小為195 bp的核苷酸序列，將3段Mhp183195bp克隆到pET100載體上，在大腸埃希氏菌上進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明，成功得到30 ku蛋白，該蛋白對(duì)His-Tag鼠單抗和Mhp特異性血清都能產(chǎn)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫原性。以上都說(shuō)明，P97蛋白具有非常好的免疫原性，是研究Mhp基因重組疫苗的突破口和關(guān)鍵所在。另外，P97蛋白引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)，能比其他抗原蛋白引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)提前很長(zhǎng)時(shí)間被檢測(cè)到，這對(duì)預(yù)防生豬EP有重大的防控意義。

3 P97蛋白的疫苗相關(guān)研究

目前，國(guó)內(nèi)外Mhp疫苗已有上市，主要有4種：滅活苗、弱毒苗、基因工程苗和聯(lián)合疫苗。其中，滅活苗占據(jù)市場(chǎng)為主，基因工程苗和聯(lián)合疫苗大部分仍在研究階段。目前市場(chǎng)上有20多種滅活苗[21]，主要有PHARMGATE生產(chǎn)的Myco Gard和Myco Gard1、ELANCO生產(chǎn)的Myco shield和Stellamune Once、勃林格生產(chǎn)的茵格發(fā)、碩騰生產(chǎn)的瑞倍適、天康生物生產(chǎn)的天支凈和瑞普生物生產(chǎn)的優(yōu)瑞適等，采用的毒株不一樣，效果也不一樣。上市的弱毒苗主要有168株和RM48株，免疫效果以細(xì)胞免疫和黏膜免疫為主[22]。

基因工程苗由于不需要添加病原，使用了DNA的重組技術(shù)，比傳統(tǒng)的滅活苗，尤其是弱毒苗要更安全，完全不同于傳統(tǒng)的商業(yè)疫苗，因此，是許多國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于基因工程苗，大部分還是處于研發(fā)階段，還沒(méi)有商品上市，主要是因?yàn)榛蚬こ堂绫容^復(fù)雜，需要對(duì)Mhp黏附因子開展詳細(xì)的研究。目前，研究人員針對(duì)Mhp黏附因子開展疫苗研究，其中主要研究的Mhp黏附因子有P97、P36、P42、P46和P95。目前有單黏附因子亞單位疫苗、腺病毒表達(dá)亞單位疫苗和重組沙門氏菌疫苗，詳細(xì)見表1[22-24]。

表1 Mhp黏附因子基因工程苗

我國(guó)很多學(xué)者也對(duì)P97基因工程疫苗展開研究工作。2019年，郭蕓蕓等[25]通過(guò)體外表達(dá)獲得了兩種重組蛋白pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1，與口蹄疫病毒滅活抗原混合免疫接種小鼠，檢測(cè)重組蛋白對(duì)口蹄疫滅活疫苗的增強(qiáng)效果，結(jié)果表明，混合接種小鼠血清中IgG明顯增加，重組蛋白混合接種小鼠，對(duì)口蹄疫疫苗有協(xié)同作用。韋艷娜等[26]通過(guò)把擴(kuò)增得到的豬肺炎支原體P97基因融合至霍亂毒素B亞單位基因下游，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-CTB-P97R1，然后與活疫苗免疫接種小鼠，檢測(cè)特異性抗體水平，結(jié)果表明，重組蛋白免疫多小鼠血清IgG抗體顯著高于對(duì)照組，能夠增強(qiáng)Mhp疫苗的免疫效力。陶宇[27]通過(guò)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表面展示技術(shù)，在桿狀病毒囊膜上同時(shí)表達(dá)豬肺炎支原體的P97 R1等蛋白，以及PCV2的Cap蛋白，并將得到的重組病毒蛋白rvAc-P97R1P46P42-Cap作為弱毒苗分別免疫小鼠和仔豬，小鼠產(chǎn)生特異性抗體IgG，脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生顯著的增殖效果，也同時(shí)能引起仔豬產(chǎn)生顯著的特異性抗體和細(xì)胞因子(IL-4和TNF-γ)，重組病毒蛋白具有較好的免疫原性。

4 小結(jié)

目前關(guān)于P97蛋白研究不少，已經(jīng)達(dá)成共識(shí)的是，P97蛋白為Mhp的主要黏附因子，P97R1區(qū)是具有黏附纖毛的功能區(qū)，并有非常好的免疫原性。同時(shí)，將P97蛋白與其他Mhp抗原蛋白，甚至是其他病原疫苗進(jìn)行重組，能夠提高機(jī)體的特異性抗體水平，增強(qiáng)免疫效力，同時(shí)還能起到協(xié)同作用。但P97蛋白使動(dòng)物感染Mhp的機(jī)理及P97蛋白工程基因疫苗在臨床應(yīng)用推廣的安全評(píng)價(jià)方面需要進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。