葉偉成，華炯鋼，倪征，云濤，陳柳，朱寅初，張存

(浙江省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

鴨坦布蘇病毒病是2010年在我國福建、浙江、江蘇等地區(qū)的蛋種鴨中首次暴發(fā)的一種新型傳染病，其病原屬于黃病科(Flaviviridae)黃病屬(Flavivirus)坦布蘇病毒(Tembusu virus)的新成員，該病主要表現(xiàn)為產蛋鴨卵巢出血壞死、萎縮、破裂等嚴重病變，產蛋率一周內可降至10%～30%[1-4]，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大損失。

疫苗免疫接種是控制動物病毒性傳染病最為經濟有效的措施。近年來，科研工作者對鴨坦布蘇病毒病疫苗的研究做了大量的工作，并取得了一定的成效，市面上不僅有不同地方毒株的滅活疫苗，還有采用不同方法致弱的活體疫苗可選[5-7]。然而不同的疫苗免疫后鴨產生抗體的快慢、消長情況等特性是不同的。本試驗旨在通過選取有代表性的鴨坦布蘇病毒病弱毒疫苗和滅活疫苗對鴨進行免疫，檢測抗體消長情況，為制定合理的免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1 d齡麻鴨購自杭州蕭山漢潮有限公司；產蛋鴨免疫試驗在紹興咸亨紹鴨育種有限公司、德清利虹禽業(yè)有限公司和諸暨國偉禽業(yè)有限公司3個公司的鴨場進行。鴨坦布蘇病毒病滅活苗HB株購自瑞普保定生物藥業(yè)有限公司，弱毒疫苗WF100株購自齊魯動物保健品有限公司，滅活疫苗ZJ407株及弱毒疫苗ZJ407-168株由本實驗室自制。ELISA試驗所需的抗原(E蛋白DⅢ結構域蛋白)包被的酶標板、標準陰性血清、標準陽性血清由本實驗室制備，辣根過氧化物酶標記的羊抗鴨IgG二抗購自美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗室免疫試驗

將50只1 d齡麻鴨在本實驗室動物房養(yǎng)至7 d齡并分成5組，免疫組每組10只，非免疫對照組10只，隔離飼養(yǎng)。免疫組按說明書上的免疫劑量分別免疫鴨坦布蘇病毒病的4種疫苗(HB株、ZJ407株滅活疫苗；WF100株、ZJ407-168株弱毒疫苗)。免疫后3周用相同劑量再免疫一次，免疫后每隔1周采一次血，分離的血清于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，直至免疫?周。

1.2.2 養(yǎng)殖場免疫試驗

ZJ407-168株弱毒疫苗在紹興咸亨紹鴨育種有限公司鴨場免疫3月齡麻鴨300只，1羽份/只；WF100株弱毒疫苗在德清利虹禽業(yè)有限公司鴨場免疫3月齡麻鴨300只，1羽份/只；HB株、ZJ407株滅活疫苗在諸暨國偉禽業(yè)有限公司分別免疫3月齡麻鴨(劑量每只1 mL)每組300只，共2組。各場免疫鴨在免疫后3周用同樣的劑量加強免疫一次，免疫后在1、2、3、4、5、6、8周、3個月、6個月時每組隨機采30只鴨的血，分離的血清于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體測定

將待檢血清樣品及標準的陰陽性血清用含10%脫脂奶粉的磷酸緩沖液(PBST)作100倍稀釋后，加入經E蛋白DⅢ結構域蛋白包被且用封閉液封閉過的酶標板上，每孔100 μL 37 ℃作用1 h后用PBST洗滌3次，每孔加入PBST作1∶15 000稀釋酶標羊抗鴨二抗，每孔100 μL 37 ℃作用1 h后用PBST洗滌3次，加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物液，每孔100 μL避光顯色10 min后，加入1 mol·L-1H2SO4(每孔50 μL)終止反應，立即于450 nm波長的酶標儀中測定D值[8-9]。

2 結果與分析

2.1 實驗室雛鴨產生抗體的規(guī)律及陽性率

雛鴨免疫后采集的血清樣品經間接ELISA檢測，大于陰性血清D4502倍判定為陽性，并計算出陽性率(表1)。從表1可見弱毒疫苗免疫組產生抗體比滅活疫苗免疫組要快14 d左右，但弱毒疫苗免疫組的抗體陽性率在4周左右就開始下降，而滅活疫苗免疫組產生抗體的陽性率4周后都達到100%。

表1 7 d齡雛鴨免疫不同疫苗后的抗體陽性率

2.2 鴨場免疫滅活疫苗后抗體檢測

產前鴨免疫鴨坦布蘇病毒病油佐劑滅活疫苗(ZJ407株、HB株)后采集血清樣品，經間接ELISA法測定獲得各樣品的D450值，并根據D450值制成散點圖(圖1)。從圖1可見這兩種疫苗免疫后產生抗體的消長情況沒有明顯差別，免疫后14 d有50%的鴨抗體呈陽性，21 d時可達90%以上，28～180 d產生的抗體都能維持在較高的水平，各鴨之間的抗體滴度比較穩(wěn)定。

2.3 鴨場免疫弱毒疫苗后抗體檢測

從圖2中可見，兩種弱毒疫苗免疫一周后大部分的鴨能夠檢測到抗體，兩周后抗體陽性率可達100%。免疫后7周的抗體檢測情況顯示，WF100株免疫后的抗體水平比較平穩(wěn)，而ZJ407-168株免疫后鴨的抗體呈下降的趨勢，這是否與免疫鴨的品種、飼養(yǎng)管理不同有關，有待進一步研究。但在180 d檢測周期的每個時間段，免疫鴨產生的抗體都是有高有低，很不一致，說明弱毒苗受免疫鴨個體差異的影響比較大。

3 討論

本研究選擇鴨坦布蘇病毒病的滅活疫苗、弱毒疫苗各兩種在實驗室及鴨場進行免疫試驗，結果表明：在實驗室、鴨場免疫結果一致，免疫鴨坦布蘇病毒弱毒活體疫苗的鴨產生抗體迅速，要比免疫滅活疫苗的鴨產生抗體的時間早14 d左右，弱毒疫苗免疫后7 d就有50%的鴨檢測到抗體，14 d時抗體陽性率可達100%；免疫滅活疫苗的鴨14 d時抗體陽性率才達到50%左右，免疫后21 d抗體陽性率為80%～90%，抗體陽性率達100%要免疫后28 d以上。這與吳曉剛等[10]報道的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗(FX2010-180P株)、段會娟等[11-12]報道的鴨坦布蘇病毒滅活疫苗(HB株)的免疫試驗結果相符。但弱毒疫苗免疫組抗體的持續(xù)時間不如滅活疫苗免疫組，弱毒疫苗免疫后3個月時抗體的陽性率就下降到60%～70%；而滅活疫苗免疫組免疫后6個月時抗體的陽性率還能維持在90%以上，且用ELISA檢測到的抗體D值都要高于弱毒活體疫苗免疫的鴨。另外，從繪制的散點圖中可以直觀地看出：滅活疫苗免疫組檢測到的抗體D值比較均一，而弱毒疫苗免疫組檢測到的抗體D值參差不齊，這與滅活疫苗免疫抗原量大，受鴨個體差異影響小，而弱毒疫苗免疫抗原量少，受免疫鴨個體差異影響大等因素有關。因此，從本研究的結果可知，弱毒疫苗具有產生抗體速度快、免疫抗原量少、不加佐劑副作用小等優(yōu)點，適合于受鴨坦布蘇病毒威脅時緊急免疫或沒有母源抗體的雛鴨首次免疫，而滅活疫苗免疫后產生抗體的持續(xù)期長，適合于產蛋鴨開產前免疫。