楊凱峰 李 俊 韓章華 程文東 王 鎖 孫武勇*

1.河南安必諾檢測(cè)技術(shù)有限公司 河南鄭州 450000

2.海南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局食品綜合協(xié)調(diào)與抽檢監(jiān)測(cè)處/海南省食品藥品檢驗(yàn)所五指山分所 海南海口 570100

3.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 河南鄭州 450000

汞是一種劇毒元素，具有元素汞、無(wú)機(jī)汞、有機(jī)汞多種形態(tài)，而有機(jī)汞中甲基汞危害最為嚴(yán)重[1]。在日常環(huán)境中，通過(guò)各種生物或非生物作用，水環(huán)境中的無(wú)機(jī)汞可能轉(zhuǎn)化成甲基汞，并且在受污染的環(huán)境中，由于生物富集作用，魚類體內(nèi)可能積累大量的甲基汞[2]，可以通過(guò)食物鏈等方式傳遞，從而危害人體健康。因此對(duì)水產(chǎn)制品的甲基汞含量檢測(cè)對(duì)保障食品安全就顯得尤為重要。

GB 5009.17-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》[3]，首次規(guī)定適用范圍包括水產(chǎn)動(dòng)物及其制品甲基汞的測(cè)定，并新增LC-ICP-MS法。該法前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、干擾小、線性范圍廣、檢出限低，可以很好地對(duì)試樣中的汞進(jìn)行形態(tài)分析和含量檢測(cè)[4]。采用該法測(cè)定魚類干制品中的甲基汞含量，并根據(jù)JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[5]和CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[6]提供的方法，通過(guò)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響的主要因素進(jìn)行分析，評(píng)估測(cè)量不確定度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)中所用試劑一般為優(yōu)級(jí)純(另有說(shuō)明除外)，水為GB/T6682一級(jí)水；

標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲基汞)，鹽酸，氨水，甲醇(色譜純)，L-半胱氨酸，乙酸銨(分析純)；

高效液相色譜儀(Ultimate 3000賽默飛)與電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Icap qc賽默飛)聯(lián)用；

電子天平(AUX120)，電子天平(AUW220D)，均為島津；

高速冷凍離心機(jī)(3K15)，德國(guó)Sigma；

超聲波清洗器(SB-25-12DTD)，寧波新芝。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)GB 5009.17—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》[3]規(guī)定的LC-ICP-MS開展實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 溶液配制

氨水溶液(1+1)：將氨水(50mL)加入水(50mL)中混勻。

鹽酸溶液(5mol/L)：鹽酸(208mL)用水稀釋至500mL。

L-半胱氨酸溶液(10g/L)：將L-半胱氨酸(0.1g)溶于水(10mL)中混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

甲醇水溶液(1+1)：將甲醇(100mL)與水(100mL)混勻。

流動(dòng)相(3%甲醇+0.04mol/L乙酸銨+1g/L L-半胱氨酸)：L-半胱氨酸(0.5g)與乙酸銨(1.6g)溶于水(100mL)中，加甲醇(15mL)，然后用水稀釋至500mL。過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，超聲脫氣30min，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

購(gòu)買來(lái)自市場(chǎng)售賣的魚類干制品樣品粉碎后，充分?jǐn)嚢杌靹?，稱取樣品0.5g至塑料離心管(15mL)中，加入5mol/L鹽酸溶液(10mL)。室溫下超聲水浴提取60min，期間振搖數(shù)次。4℃，8 000r/min離心15min。準(zhǔn)確移取上清液(2.0mL)至容量瓶(5mL)中，逐滴加入氨水溶液(1+1)，至樣液pH值3～7。加入10g/L L-半胱氨酸溶液(0.1mL)，用水定容。過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，待測(cè)?？瞻自囼?yàn)同上。

1.2.3 儀器條件

(1)液相色譜條件。

色譜柱：C18分析柱(150mm×4.6mm,5μm)。

流動(dòng)相：3%甲醇+0.04mol/L乙酸銨+1g/L L-半胱氨酸。

流速：1.0mL/min。

進(jìn)樣量：50μL。

(2)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀條件。

射頻功率：1 500W。

采樣深度：8mm。

霧化室溫度：2℃。

載氣(氬氣)流量：0.85L/min。

補(bǔ)償氣(氬氣)流量：0.15L/min。

積分時(shí)間：0.5s。

檢測(cè)質(zhì)荷比(m/z)：202。

1.3 測(cè)定結(jié)果的數(shù)學(xué)模型

按公式(1)計(jì)算試樣中甲基汞的含量(以Hg計(jì))。

(1)

式中：

X—試樣中甲基汞的含量(以Hg計(jì))，mg/kg；

c—經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的測(cè)定液中甲基汞的濃度，μg/L；

c0—經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白溶液中甲基汞的濃度，μg/L；

v—加入提取試劑的體積，mL；

f—稀釋因子，2.5；

m—試樣稱樣量，g；

1 000—換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引入不確定度的來(lái)源

通過(guò)研究食品中甲基汞檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和評(píng)估測(cè)量不確定度的方法，分析對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響的原因，以此確定不確定度分量來(lái)源。測(cè)定結(jié)果主要受樣品測(cè)量重復(fù)性、樣品的稱量過(guò)程、樣品前處理過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等方面的影響。

2.2 不確定度分量的評(píng)估

2.2.1 評(píng)估重復(fù)測(cè)量引入的不確定度urel(rep)

樣品中甲基汞的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 樣品中甲基汞的測(cè)定結(jié)果Table 1 Measurement results of methylmercuryin samples

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室用于食品中甲基汞檢測(cè)新方法開驗(yàn)的樣品之一魚類干制品經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)定，確認(rèn)含量穩(wěn)定，稱取過(guò)程應(yīng)保持穩(wěn)定，盡量降低結(jié)果偏差。準(zhǔn)確稱取混勻后魚類干制品樣品10份，分別測(cè)定其中的甲基汞含量。

測(cè)量重復(fù)性以通過(guò)貝塞爾公式(2)計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)偏差表示：

(2)

其中：

xi—第i次的測(cè)量值;

n—獨(dú)立重復(fù)測(cè)量次數(shù);

計(jì)算樣品中，甲基汞重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

2.2.2 評(píng)估樣品稱量引入的不確定度urel(m)

樣品采購(gòu)于周口某市場(chǎng)，檢測(cè)備樣保存期滿后，實(shí)驗(yàn)室新方法開驗(yàn)選用，粉碎充分、均勻，此處不考慮其引入的不確定度。在此過(guò)程中對(duì)樣品稱量結(jié)果影響較大的是電子天平的使用。通過(guò)對(duì)使用的萬(wàn)分之一電子天平的校準(zhǔn)證書進(jìn)行查詢，結(jié)果顯示：U=0.0009g，k=2。

根據(jù)檢測(cè)方法操作，稱量樣品0.500g，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

u(m)=U/k=0.00045g

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(m)=u(m)/m=0.0009

2.2.3 評(píng)估樣品前處理過(guò)程引入的不確定度urel(v)

樣品前處理過(guò)程中，因移取提取液及定容等操作需要用到10mL、1mL移液器和5mL容量瓶。

實(shí)驗(yàn)溫度在(20±5)℃時(shí)，ΔT=5℃，此時(shí)水的膨脹系數(shù)為α=0.00021/℃。

溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式(3)：

(3)

移液器(10mL、1mL)和容量瓶(5mL)的使用而引入的不確定度見表2。

合成計(jì)算得樣品前處理過(guò)程中引入的不確定度評(píng)定結(jié)果：

2.2.4 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(c)

標(biāo)準(zhǔn)溶液的使用要考慮其純度，儲(chǔ)備液的配制過(guò)程，中間工作液的配制過(guò)程以及標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的配制過(guò)程等方面的影響，相關(guān)不確定度的評(píng)估從這幾方面入手。

(1)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的不確定度urel(c1)。

查詢標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲基汞)證書((63.5±2.4)μg/g，k=2)，折算單體純品率93%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(c1)=2.4/2=1.2μg/g。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(c1)=1.2/63.5=0.019

(2)評(píng)估儲(chǔ)備液配制引入的不確定度urel(c2)。

①評(píng)估稱量引入的不確定度urel(c2-1)。

通過(guò)查詢此過(guò)程所用的十萬(wàn)分之一電子天平的校準(zhǔn)證書可得，校準(zhǔn)結(jié)果顯示：載荷值0.1g時(shí)，U=0.00006g，k=2。準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.0847g，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

u(c2-1)=U/k=0.00003g

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(c2-1)=u(c2-1)/m=0.0004

②評(píng)估定容引入的不確定度urel(c2-2)。

定容用容量瓶(5mL)。溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算方法同上。

使用5mL容量瓶引入的不確定度評(píng)定結(jié)果見表3。

表3 使用5mL容量瓶引入的不確定度評(píng)定結(jié)果Table 3 Uncertainty Evaluation Results Introduced by Using a 5 mLvolumetric Flask

合成計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液配制引入的不確定度評(píng)定結(jié)果：

(3)評(píng)估中間工作液配制引入的不確定度urel(c3)。

該過(guò)程引入的不確定度主要受使用移液器(1mL)和容量瓶(10mL)的影響。溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算方法同上。

使用移液器(1mL)和容量瓶(10mL)引入的不確定度評(píng)定結(jié)果見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液中間工作液配制引入的不確定度評(píng)定結(jié)果Table 4 Evaluation Results of Uncertainty Introduced in the Preparation of Standard Solution Intermediate Working Solution

合成計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)溶液中間工作液配制所引入的不確定度評(píng)定結(jié)果：

(4)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液配制引入的不確定度urel(c4)。

該過(guò)程引入的不確定度主要是需要使用容量瓶(1mL)，移液器(1mL，0.2mL)的影響，配制濃度分別為0.5、1、5、10、20、50ng/mL，用0.2mL移液器分別移取0.005、0.01、0.05、0.1、0.2mL，用1mL移液器移取0.5mL。溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算方法同上。

容量瓶(1mL)共使用6次，引入的不確定度見表5。

表5 使用1mL容量瓶引入不確定度評(píng)定結(jié)果Table 5 Using a 1mL volumetric flask to introduce uncertainty evaluation results

0.5、1、5、10、20、50ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入不確定度評(píng)定結(jié)果見表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液各點(diǎn)引入不確定度評(píng)定結(jié)果Table 6 Evaluation results of introducing uncertainty at each point of standard curve series solution

續(xù)表6

合成計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的配制引入不確定度評(píng)定結(jié)果：

最后合成計(jì)算得引入的不確定度評(píng)定結(jié)果：

urel(c)=

2.2.5 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(q)

根據(jù)所得的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX+b，對(duì)各濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液濃度測(cè)定結(jié)果Table 7 Standard curve series solution concentration determination result

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所引入的不確定度可以通過(guò)公式(4)和公式(5)進(jìn)行計(jì)算[7]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為：

(4)

(5)

式中：

Ci—實(shí)際繪制擬合直線各點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/mL;

X—標(biāo)準(zhǔn)曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/mL;

S—標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)偏差;

Ai—標(biāo)準(zhǔn)曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的峰面積;

a—斜率20 731.0560;

b—截距2 168.4969;

n—校準(zhǔn)溶液測(cè)試總次數(shù)18;

P—樣品測(cè)試次數(shù)10;

C0—樣品實(shí)測(cè)平均濃度。

經(jīng)計(jì)算得出：

C0=1.8700ng/mL

S=2075.7889

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u(q)=0.049ng/mL

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度評(píng)定結(jié)果：

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定結(jié)果見表8。

表8 各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定結(jié)果Table 8 Evaluation results of relative standard uncertainty of each component

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(X)=

魚類干制品中甲基汞含量測(cè)定的平均值為0.093mg/kg。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u(X)=urel(X)×0.093mg/kg=0.007mg/kg

2.4 擴(kuò)展不確定度及不確定度結(jié)果報(bào)告

置信區(qū)間為95%的情況下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度評(píng)定結(jié)果為：

U(X)=k×u(X)=0.014mg/kg

魚類干制品中甲基汞含量結(jié)果:

(0.093±0.014)mg/kg，k=2

3 結(jié)論

采用GB 5009.17—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》中第二篇第二法，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法，測(cè)定魚類干制品中甲基汞含量，并進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定。從不確定度評(píng)定過(guò)程來(lái)看，考慮到該樣品是用于新方法開驗(yàn)樣品之一，實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格規(guī)范控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程，操作謹(jǐn)慎，同時(shí)樣品中甲基汞含量較低，測(cè)量過(guò)程中對(duì)結(jié)果影響較大的因素主要是標(biāo)準(zhǔn)溶液純度及配制、曲線擬合，但作為日常檢測(cè)中測(cè)量不確定度主要來(lái)源的測(cè)量重復(fù)性同樣重要，日常檢測(cè)工作的開展要應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這些方面。由此可知實(shí)驗(yàn)設(shè)備的精度、操作的規(guī)范性，對(duì)測(cè)量不確定度有較大影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意對(duì)各因素進(jìn)行有效控制可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。