劉維兵 蒙富聲 楊松濤 李彥榮 張慎孝 楊 林 包曉瑋*

1.青島德慧海洋生物科技有限公司 山東青島 266000

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 新疆烏魯木齊 830000

3.正大農(nóng)業(yè)科技(浙江)有限公司 浙江慈溪 315300

決明子(Catsia tora Linn)，別稱為草決明、馬蹄決明等，豆科決明屬植物。

決明子具有清肝明目，潤(rùn)腸通便，并具有一定降血壓，降血脂作用，決明子中存在大黃酚、橙黃決明素等具有抑菌譜較為廣泛，將決明子中黃色素(天然植物色素)進(jìn)行提取，作為食品著色劑也被人們普遍認(rèn)可[1，2]，超聲輔助提取是利用超聲波具有的穿透能力[3，4]，較強(qiáng)的剪切力使植物細(xì)胞膜快速破裂，其細(xì)胞內(nèi)的分子化合物，能快速的與提取溶劑相結(jié)合，并縮短提取時(shí)間，增加黃色素的提取率，但傳統(tǒng)的植物色素穩(wěn)定性較差，在強(qiáng)光照射下極易被分解，且在較高的溫度下也會(huì)造成植物色素的降解[5，6]。

本試驗(yàn)采用超聲輔助法提取決明子色素，應(yīng)用單因素試驗(yàn)方法觀察不同試驗(yàn)條件對(duì)色素提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)法對(duì)提取工藝進(jìn)行分析與優(yōu)化。并將提取出的決明子色素進(jìn)行保護(hù)，通過單因素結(jié)合正交試驗(yàn)法，選取最佳的保護(hù)工藝。

通過對(duì)比試驗(yàn)證明經(jīng)保護(hù)后的決明子色素具有較高的穩(wěn)定性，且具有較強(qiáng)的抗氧氧化活性。為后續(xù)決明子色素的進(jìn)一步開發(fā)和使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

決明子，青島德慧海洋生物科技有限公司;

1，1-二苯基-2-三硝基苯(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2，2’-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)，美國(guó)Sigma公司；

維生素C、維生素E，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

乙醇等其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

閉路噴霧干燥機(jī)，CPSD-5，常州志恒責(zé)任有限公司；

粉碎機(jī)，XL-02A，燁昌機(jī)械有限公司；

超聲波處理機(jī)，JBT/C-YCL400T/3P(D)，濟(jì)寧金佰特工程機(jī)械有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52B，上海亞榮生化儀器廠；

電動(dòng)離心機(jī)，80-1，金壇市恒豐儀器廠；

紫外分光光度計(jì)，UV-2550，島津試驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

將決明子種子磨碎，利用粉碎機(jī)負(fù)壓將質(zhì)量較輕的胚芽粉收集起來，備用。

1.3.1 設(shè)計(jì)決明子色素提取單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 乙醇濃度對(duì)提取決明子色素影響

準(zhǔn)確稱取100g決明子胚芽粉，根據(jù)前人研究準(zhǔn)確控制超聲時(shí)間為30min，超聲功率為120W,料液比為1∶30，設(shè)置乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%，提取結(jié)束后4 000r離心取上層清液，檢測(cè)其在324nm處的吸光值，平行測(cè)定3次[7，8]。

1.3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)提取決明子色素影響

準(zhǔn)確稱取100g決明子胚芽粉，根據(jù)前人研究準(zhǔn)確控制超聲功率為120W,料液比為1∶30，乙醇濃度為50%，設(shè)置超聲時(shí)間為10、20、30、40、50min，提取結(jié)束后4 000r離心取上層清液，檢測(cè)其在324nm處的吸光值，平行測(cè)定3次。

1.3.1.3 超聲功率對(duì)提取決明子色素影響

準(zhǔn)確稱取100g決明子胚芽粉，根據(jù)前人研究準(zhǔn)確控制超聲時(shí)間為30min，料液比為1∶30，乙醇濃度為50%，設(shè)置超聲功率為60、80、100、120、140W，提取結(jié)束后4 000r離心取上層清液，檢測(cè)其在324nm處的吸光值，平行測(cè)定3次。

1.3.1.4 料液比對(duì)提取決明子色素影響

準(zhǔn)確稱取100g決明子胚芽粉，根據(jù)前人研究準(zhǔn)確控制超聲時(shí)間為30min，乙醇濃度為50%，超聲功率為120W，設(shè)置料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取結(jié)束后4 000r離心取上層清液，檢測(cè)其在324nm處的吸光值，平行測(cè)定3次。

1.3.2 設(shè)計(jì)決明子色素提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，影響決明子色素提取含量的主要因素有：乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、料液比。故以此四因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以提取物中在324nm處的吸光值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定提取的最佳工藝條件(見表1)。

1.3.3 決明子穩(wěn)定性及抗氧化性單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 α-氨基酸添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性及抗氧化性的影響

經(jīng)上述方法提取出的決明子色素，根據(jù)前人研究，控制檸檬酸添加量為質(zhì)量比的1%，維生素C、維生素E的添加量各為質(zhì)量比的3%，β-環(huán)糊精與麥芽糊精的配比為3∶1，質(zhì)量比為20%，設(shè)置α-氨基酸的添加量各為質(zhì)量比的1%、3%、5%、7%、9%，噴霧干燥后取1g決明子色素粉，溶于100mL蒸餾水中，進(jìn)行決明子色素粉的穩(wěn)定性試驗(yàn)及抗氧化試驗(yàn)測(cè)定，平行測(cè)定3次[9,10]。

1.3.3.2 檸檬酸添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性及抗氧化性的影響

經(jīng)上述方法提取出的決明子色素，根據(jù)前人研究，控制維生素C、維生素E的添加量各為質(zhì)量比的3%，β-環(huán)糊精與麥芽糊精的配比為3∶1，質(zhì)量比為20%，α-氨基酸的添加量各為質(zhì)量比的5%，設(shè)置檸檬酸添加量為1%、2%、3%、4%、5%，噴霧干燥后進(jìn)行決明子色素粉的穩(wěn)定性試驗(yàn)及抗氧化試驗(yàn)測(cè)定，平行測(cè)定3次。

1.3.3.3 維生素添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性及抗氧化性的影響

經(jīng)上述方法提取出的決明子色素，根據(jù)前人研究，控制β-環(huán)糊精與麥芽糊精的配比為3∶1，質(zhì)量比為20%，α-氨基酸的添加量各為質(zhì)量比的5%，檸檬酸添加量為2%，設(shè)置維生素的添加量各為質(zhì)量比的1%、2%、3%、4%、5%，噴霧干燥后進(jìn)行決明子色素粉的穩(wěn)定性試驗(yàn)及抗氧化試驗(yàn)測(cè)定，平行測(cè)定3次。

1.3.3.4 β-環(huán)糊精與麥芽糊精的配比對(duì)決明子色素穩(wěn)定性及抗氧化性的影響

經(jīng)上述方法提取出的決明子色素，根據(jù)前人研究，控制α-氨基酸的添加量各為質(zhì)量比的5%，檸檬酸添加量為2%，維生素的添加量各為質(zhì)量比的3%，設(shè)置β-環(huán)糊精與麥芽糊精的配比分別為1∶5、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1，添加量為質(zhì)量比的20%，噴霧干燥后進(jìn)行決明子色素粉的穩(wěn)定性試驗(yàn)及抗氧化試驗(yàn)測(cè)定，平行測(cè)定3次。

1.3.4 設(shè)計(jì)決明子色素保護(hù)正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，影響決明子色素穩(wěn)定性及抗氧化性的主要因素有:α-氨基酸添加量、檸檬酸添加量、維生素添加量、β-環(huán)糊精與麥芽糊精配比。故以此4因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以決明子色素的耐100℃高溫試驗(yàn)、及對(duì)DPPH自由基的清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳保護(hù)工藝條件(見表2)。

表2 因素及水平表Table 2 Factor levels design table

1.3.5 決明子色素穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.5.1 光照實(shí)驗(yàn)

取保護(hù)前、后決明子色素粉各1g，分別溶于100mL蒸餾水中，將決明子色素粉溶液分別置于陽光下，與室內(nèi)避光的櫥窗里，隔8h分別測(cè)定決明子色素溶液在324nm處的吸收波長(zhǎng)[11,12]。

1.3.5.2 耐高溫實(shí)驗(yàn)

取保護(hù)前、后決明子色素粉各1g，分別溶于100mL蒸餾水中，將決明子色素溶液置于100℃的恒溫水浴鍋中，恒溫2h后測(cè)定決明子色素溶液在324nm處的吸收波長(zhǎng)[13,14]。

1.3.6 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.6.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考艾拉旦·麥麥提艾力等[15]方法稍作修改，用無水乙醇配制成0.2mmol/L的DPPH工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。取1mL樣品，濃度為1.0mg/mL，向樣品中加入2mL DPPH溶液(0.2mmol/L)，振蕩搖勻并在室溫下黑暗中反應(yīng)30min(避光)，測(cè)定517nm處吸光度值，采用同濃度的Vc溶液做陽性比較。按公式(1)計(jì)算清除率：

(1)

式中：

Ai為1mL樣品(Vc)與2mL DPPH溶液的吸光度；

Aj為1mL樣品(Vc)與2mL無水乙醇的吸光度；

A0為1mL蒸餾水與2mL DPPH的吸光度。

1.3.6.2 對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)Wang[16](2012)等的方法稍作修改。配置1.0mg/mL濃度的樣品溶液1mL，將4mL ABTS工作液加入試管中，充分混合均勻，室溫暗處反應(yīng)6min，于734 nm處測(cè)定吸光度，以相同濃度的Vc溶液為陽性對(duì)照，按公式(2)計(jì)算其清除率：

(2)

式中：

Ai為1mL樣品(Vc)與4mL ABTS的吸光度；

Aj為1mL樣品(Vc)與4 mL蒸餾水的吸光度；

A0為1mL蒸餾水與4mL ABTS溶液的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)操作，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，處理結(jié)果均以X±SD表示，圖表制作利用Excel 2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 決明子色素提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)決明子色素提取率的影響

由圖1可知：乙醇濃度為50%時(shí)，在324nm處吸光值達(dá)到最大，隨著乙醇濃度的不斷增加，最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值會(huì)逐漸降低，低濃度的乙醇提取的決明子色素，也顯著低于50%乙醇作為溶劑提取出的決明子色素吸光值。

圖1 乙醇濃度對(duì)決明子色素提取率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of pigment from Semen Cassiae

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)決明子色素提取率的影響

由圖2可知：決明子色素在10～30min之間提取的提取率在逐步升高，在30min時(shí)達(dá)到峰值，超過30min以后決明子色素的提取率會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)決明子色素提取率的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic time on extraction rate of pigment from Semen Cassiae

2.1.3 超聲功率對(duì)決明子色素提取率的影響

由圖3可知：決明子色素的提取率在60～120W時(shí)隨著超聲功率的增加而升高，在120W時(shí)達(dá)到了峰值，到達(dá)峰值后再升高功率，決明子色素的提取率則出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 超聲功率對(duì)決明子色素提取率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of pigment from Semen Cassiae

2.1.4 料液比對(duì)決明子色素提取率的影響

由圖4可知：隨著料液比的逐漸升高，決明子色素的提取率逐漸呈下降趨勢(shì)，在料液比為1∶10～1∶20時(shí)，對(duì)決明子色素的提取率影響，差異不顯著(p>0.05)，但當(dāng)料液比大于1∶20以后決明子色素提取率會(huì)逐漸降低且差異顯著(p<0.05)。

圖4 料液比對(duì)決明子色素提取率的影響Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Cassia Seed Pigment

2.2 決明子色素提取率正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳工藝參數(shù)的確定

決明子色素提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

通過對(duì)表3試驗(yàn)極差值分析可知，影響決明子色素提取的因素主次分別為，乙醇濃度>料液比=超聲時(shí)間>超聲功率；綜合對(duì)因素A、B、C、D進(jìn)行分析，在A2B3C1D2工藝參數(shù)下，得到的決明子色素最大吸光值為1.266Abs，因此最佳提取工藝為乙醇濃度為50%，料液比為1∶20，超聲時(shí)間為40min，超聲功率為100W。

表3 L9(34)決明子色素提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results of L9(34)Cassia Seed Pigment Extraction

2.3 影響決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 α-氨基酸添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響

由圖5可知：隨著α-氨基酸添加量的增加，決明子色素的耐熱能力也在不斷增大，同樣對(duì)DPPH的清除能力也隨著α-氨基酸添加量的增加，而不斷增加，呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)，但當(dāng)α-氨基酸添加量達(dá)到5%時(shí)，隨著添加量的不斷增大，其耐熱能力及對(duì)自由基清除能力不再隨α-氨基酸添加量的增大而增長(zhǎng)。

圖5 α-氨基酸添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響Fig. 5 Effect of material liquid ratio on extraction rate of Cassia Seed Pigment

2.3.2 檸檬酸添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響

由圖6可知：隨檸檬酸添加量的增加，決明子色素的耐熱能力及對(duì)自由及清除能力也隨之增加，但當(dāng)檸檬酸添加量為2%，出現(xiàn)拐點(diǎn)，隨檸檬酸添加量不斷增大，其耐熱能力及對(duì)自由及清除能力基本保持不變。

圖6 檸檬酸添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響Fig. 6 Effect of citric acid addition on the stability and antioxidant activity of Cassia Seed Pigment

2.3.3 維生素添加量對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響

由圖7可知：隨著維生素添加量的不斷增加，決明子色素的耐熱能力也在不斷增大，同樣對(duì)DPPH的清除能力也隨著維生素添加量的增加而不斷增加，呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)，但當(dāng)維生素添加量達(dá)到3%時(shí)，隨著添加量的不斷增大，其耐熱能力及對(duì)自由基清除能力不再隨維生素添加量的增大而增長(zhǎng)。

2.3.4 β-環(huán)糊精與麥芽糊精配比對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響

由圖8可知：在環(huán)糊精與麥芽糊精的配比中，隨環(huán)糊精所占比重的加大，決明子色素的耐熱能力及對(duì)自由基清除能力也隨之增加，但當(dāng)環(huán)糊精與麥芽糊精配比為3∶1時(shí)，其耐熱能力達(dá)到頂峰，隨環(huán)糊精所占比重的不斷增大，其耐熱能力基本保持不變。

圖8 β-環(huán)糊精與麥芽糊精配比對(duì)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性的影響Fig. 8 β- Effects of the ratio of cyclodextrin and maltodextrin on the stability and antioxidant activity of jumingzi pigment

2.4 保護(hù)決明子色素正交試驗(yàn)結(jié)果

決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

由表4分析結(jié)果：通過穩(wěn)定性試驗(yàn)極差值可以看出，影響決明子色素穩(wěn)定性因素主次為β-環(huán)糊精與麥芽糊精配比>α-氨基酸添加量>檸檬酸添加量>維生素添加量；通過抗氧化性試驗(yàn)極差值可以看出，影響決明子色素抗氧化性因素主次為維生素添加量>檸檬酸添加量>β-環(huán)糊精與麥芽糊精配比>α-氨基酸添加量；綜合對(duì)因素A、B、C、D進(jìn)行分析，在A2B1C2D3工藝參數(shù)下，得到的決明子色素不僅有較強(qiáng)的耐高溫能力，而且具有較強(qiáng)的抗氧化能力。因此選擇A2B1C2D3為最佳提取工藝，α-氨基酸添加量5%，檸檬酸添加量1%，維生素添加量3%，β-環(huán)糊精與麥芽糊精的配比為3∶1。

表4 L9(34)決明子色素穩(wěn)定性、抗氧化性正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Orthogonal design and results of L9(34) Cassia Seed Pigment stability and antioxidation

2.5 決明子色素保護(hù)前、后對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力對(duì)比

DPPH自由基，是一種較為穩(wěn)定的自由基，其獲得穩(wěn)定的氮自由基，是由于存在多個(gè)吸電子基團(tuán)，該自由基最大的吸收峰為517nm，可以成為抗氧化能力檢測(cè)較為優(yōu)異的選擇[17]。

ABTS自由基的特征吸收峰通常選擇在734nm，通常用該波長(zhǎng)來檢測(cè)吸光度的改變[18]。ABTS法是判斷還原物質(zhì)清除自由基能力較為常見的方法之一，因?yàn)锳BTS具有還原性，容易被氧化成較為ABTS+自由基，這種自由基是一種較為穩(wěn)定的藍(lán)綠色自由基[19]。其褪色是與抗氧化物質(zhì)相結(jié)合[20]。褪色程度越強(qiáng)，吸光度越低，抗氧化能力可通過吸光度值大小判斷[21]。

由圖9可以看出：決明子色素在未經(jīng)保護(hù)處理，噴霧干燥得到?jīng)Q明子色素粉，其清除自由基能力較差；但經(jīng)處理保護(hù)后的決明子色素粉，具有較強(qiáng)的清除自由基能力，在體外具有較高的抗氧化能力，經(jīng)保護(hù)后的決明子色素粉，相較于未經(jīng)保護(hù)的決明子色素粉其對(duì)DPPH自由基的清除能力提升1.56倍，對(duì)ABTS自由基的清除能力提升1.88倍，差異顯著(p<0.01)。

圖9 決明子色素保護(hù)前、后對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力對(duì)比Fig. 9 Scavenging ability of Cistanche deserticola polysaccharide on DPPH,ABTS free radical

2.6 決明子色素保護(hù)前、后穩(wěn)定性能力對(duì)比

2.6.1 決明子色素保護(hù)前、后耐光能力比對(duì)

如圖10所示：決明子色素粉在未作保護(hù)前，其耐光、耐熱能力較差；而經(jīng)保護(hù)后其耐光、耐熱能力分別增加了2.63倍、3.28倍，差異顯著(p<0.01)。

圖10 決明子色素保護(hù)前、后耐光、耐熱能力對(duì)比Fig. 10 comparison of light resistance and heat resistance of cassia seed before and after pigment protection

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以決明子胚芽粉為原料，經(jīng)不同工藝提取，最終證明不同的提取工藝色素提取率差異顯著，最終選擇最佳提取工藝為：超聲時(shí)間40min、料液比1∶20、乙醇濃度50%、超聲功率100W；未經(jīng)保護(hù)噴霧干燥出的決明子色素粉，其耐光耐熱性較差，而經(jīng)保護(hù)后噴霧干燥出的決明子色素粉，其耐光耐熱能力分別提高了2.63倍、3.28倍。

綜上所述，經(jīng)保護(hù)的決明子色素不僅在體外具有良好的抵御氧化作用能力，而且解決了傳統(tǒng)決明子色素不耐高溫，強(qiáng)光下分解的弊端，為決明子色素的開發(fā)利用提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。