王曉佳 計慧姝 歐 潔

1.重慶市動物園管理處，重慶 400000；2.四川省甘孜藏族自治州動物疫病預防控制中心，四川康定 626000

大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是世界上現(xiàn)存最大也是最珍貴的兩棲動物，屬國家二級重點保護野生動物。近幾年市民送入重慶動物園的大鯢越來越多，但是由于野生環(huán)境的惡化及運輸過程中或送養(yǎng)前飼養(yǎng)條件較差，送來的大鯢多半患有嚴重的感染性疾病和外傷（皮膚病變或有外傷的占1/2 以上），2011年1月至2014年4月共死亡15 尾，死亡率達31%。因此，對大鯢常見致病菌的排查和研究，以及其生存環(huán)境的仿生態(tài)化研究刻不容緩。目前，根據(jù)國內(nèi)外的相關研究資料來看，大鯢常見疾病主要有赤皮病、腐皮病、水霉病、線蟲病、浮頭病、彎體病和堿中毒等。其中，感染大鯢細菌性病病原菌主要為氣單胞菌屬，如嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、熒光假單胞菌（Pseudomonasflu orescence）等[1-3]。由氣單胞菌引發(fā)的赤皮病、腐皮病及腹水病，一年四季都有發(fā)生，多是在大鯢捕獲、運輸、放養(yǎng)時身體受到機械損傷，或體表被寄生蟲寄生受損時，病原菌入侵體表，引起大鯢發(fā)病。水霉菌引發(fā)的水霉病，全年均可發(fā)病，2、4月為流行高峰，主要是由水質惡化和機體受傷而誘發(fā)，水溫過低也有可能引發(fā)該病。當水質太肥、水溫過高時，易造成大鯢缺氧，引發(fā)浮頭病。重度缺氧會引起大鯢體色變深、行動不便，輕度缺氧其頭部浮出水面張大嘴艱難呼吸。當水體重金屬鹽類超標時，會刺激鯢的神經(jīng)和肌肉收縮而導致彎體病，即鯢脊椎呈S 型彎曲[4]；當水質呈堿性時易誘發(fā)堿中毒疾病。

重慶市動物園長期承擔飼養(yǎng)救護大鯢工作，目前園區(qū)共計飼養(yǎng)大鯢40 余條，根據(jù)重慶市動物園的實際條件，后備隔離飼養(yǎng)池采取人工水池飼養(yǎng)大鯢，飼養(yǎng)池采取長流水的方式進行水體更換，在換水通道處采用多層過濾棉層的方法過濾雜質。所有隔離池頂層加裝網(wǎng)棚，確保樹葉等雜物不會掉落入池。展出池則采取水泥池飼養(yǎng)，沒有隔離池周邊植物落葉的裝置，采取定期徹底排空水體，清洗池壁的方法維持水體清潔度。目前的飼養(yǎng)環(huán)境是否能夠為大鯢提供合適的生存環(huán)境尚不清楚。筆者希望通過對已有的大鯢發(fā)病情況、各個飼養(yǎng)池水體的自然帶菌情況、飼養(yǎng)中健康大鯢的體表帶菌情況、水體水質等結果進行綜合分析，得到適合重慶市動物園的飼養(yǎng)大鯢方法。本研究的試驗結果將對重慶動物園大鯢的救護起到指導作用，也為今后的人工繁殖工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

重慶動物園2014年6月共飼養(yǎng)35 條大鯢，以及至2019年6月項目進行過程中救護的大鯢均為試驗對象。

1.2 試驗方法

1）飼養(yǎng)池分組。將兩爬館大鯢飼養(yǎng)池分為2 組：①第一組，隔離池組，水池攜帶自來水過濾棉系統(tǒng)進行水質控制。按照從左到右、從入口到內(nèi)室的方向分別編號為1～8。②第二組，展出池，自然放置，每周水全部排干1 次，并清洗池底，編號為9 號。

2）大鯢體表帶菌情況分析方法。隨機于各個隔離池內(nèi)挑選目標大鯢2 條，用無菌棉簽在大鯢體表（背面）頭部、背部、四肢共計采集6 個位點的皮膚黏液樣本，接種于LB 固體培養(yǎng)基平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)不同的單菌落于LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)增菌培養(yǎng)，將細菌培養(yǎng)液送至生物檢測公司進行細菌通用16S RNA 序列PCR 擴增并測序，測序結果與SCI GenBank 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對分析，依據(jù)相似度最高的序列為菌種判定結果，低于95%的序列判斷為未知菌種。

擴增引物選取細菌16S rRNA 基因通用引物[5]：

上游引物：5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3’；

下游引物：5’—GGTTACCTTGTTACGACTT—3’。

PCR 擴增體系：選用TaKaRa 公司的Ex Taq 用于目的片段的克隆分析。

25 μL 體系：ddH2O 14 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix(2 mmol/L) 2.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.3 μL，DNA 模板2 μL。

PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延長10 min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 反應產(chǎn)物，選取陽性結果進行基因測序。

3）飼養(yǎng)水體帶菌情況分析方法。隨機于各個飼養(yǎng)池內(nèi)抽取水樣1 mL，將20 μL 液體樣本接種于LB 固體培養(yǎng)基平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)不同的單菌落于LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)增菌培養(yǎng)，將細菌培養(yǎng)液送至生物檢測公司進行細菌通用16S RNA 序列PCR 擴增并測序，測序結果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對分析，依據(jù)相似度最高的序列為菌種判定結果，低于95%的序列判斷為未知菌種。細菌鑒定試驗方法同本文1.2.2）。

4）飼養(yǎng)水體菌落計數(shù)方法。采取平板菌落計數(shù)法進行水體菌落計數(shù)，隨機于各個飼養(yǎng)池內(nèi)抽取水樣1 mL，將樣本涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，計數(shù)平板上單菌落數(shù)量，根據(jù)溶液量計算出每毫升水體含菌量。

5）藥敏試驗方法。由于重慶市動物園隔離池位置集中且處于開放式環(huán)境，菌群生存環(huán)境互通，因此藥敏試驗分為2 組，分別為隔離池組和展出池組。

①藥敏紙片制作。依據(jù)重慶市動物園常用水生藥品種類，選擇3 種常用藥品作為檢測藥品，將中速濾紙打孔制作相同直徑圓形紙片。選取帶膠頭塞廢棄安倍瓶，清洗干燥后，每瓶放入10 片制作完成的紙片，封口后高壓滅菌備用。按照表1調(diào)整藥液濃度，采用0.22 μm 濾器過濾藥液。在無菌環(huán)境下將制備完畢的藥液灌放入有紙片的安倍瓶，藥液必須沒過紙片，封口后于烘干箱內(nèi)烘干藥液（烘干箱溫度不得超過60 ℃），保證藥液完全浸入紙片。

表1 藥液質量濃度

②藥敏試驗。在展出池中取10 μL 水樣，涂布LB 固體培養(yǎng)基，編號為飼養(yǎng)池組。隔離池8 個池水樣混合后取10 μL 水樣，涂布LB 固體培養(yǎng)基，編號為隔離池組。2 組培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別用100 μL 無菌生理鹽水混勻菌落并涂布整板。于平板上粘貼藥敏紙片，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，計數(shù)抑菌圈直徑，依據(jù)抑菌圈直徑判斷藥物是否敏感。

③藥物敏感試驗判定標準。抑菌圈直徑（mm）在20 以上為極度敏感；15～20 為高度敏感；10～14為中度敏感；10 以下為低度敏感；低于或等于1 為不敏感。

6）飼養(yǎng)水體水質檢測方法。隨機選取室內(nèi)飼養(yǎng)池3 個，飼養(yǎng)外池1 個，每個飼養(yǎng)池采集6 份600 mL水樣，送重慶渝久環(huán)保產(chǎn)業(yè)有限公司進行pH 值、總磷、總氮、化學需氧量、五日生化需氧量、高錳酸鹽指數(shù)等6 項水質分析檢測。依據(jù)《地表水環(huán)境質量標準GB3838-2002》對地表水環(huán)境質量標準基本項目標準限值判斷送檢水樣質量水平。

2 結果與分析

2.1 臨床病例分析

由于檔案數(shù)據(jù)不完善，2014-2015年死亡報告不完整，因此死亡原因從2016年開始分析。2016年1月至2019年6月共計救護大鯢78 條，救護的大鯢醫(yī)治無效死亡共計43 條，最常見原因為腐皮病以及腐皮病引發(fā)的黏膜層脫落（表2）。

表2 2016-2019年大鯢死亡情況統(tǒng)計條

2.2 大鯢體表帶菌情況

1 號池：1 號大鯢體表分離到1 株亞硝化單胞菌目的細菌。

4 號池：1 號大鯢體表分離到1 株水生魚類腸道菌群中1 種細菌。

6 號池：2 號大鯢分離到1 株嗜水氣單胞菌和1株熒光假單胞菌。

8 號池：2 號大鯢分離到1 株氣單胞菌。

2、3、5、7 號池內(nèi)飼養(yǎng)的大鯢體表未分離到細菌。

2.3 飼養(yǎng)水體帶菌情況

1 號池：分離到弗氏檸檬酸桿菌。

2 號池：分離到假單胞菌。

3 號池：分離到氣單胞菌、假單胞菌。

4 號池：分離到氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、氣單胞菌。

5 號池：分離到氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、假單胞菌。

6 號池：分離到氣單胞菌、惡臭假單胞菌。

7 號池：分離到芽孢桿菌、檸檬酸桿菌、假單胞菌。

8 號池：分離到檸檬酸桿菌。

2.4 水體菌落計數(shù)

水體菌落計數(shù)顯示（表3），6 號池菌落數(shù)最多，9 號池菌落數(shù)最少，分別為521 個/mL 和32個/mL。

表3 菌落計數(shù)結果

2.5 細菌藥敏試驗

展出池黃粉抑菌圈為10 mm，達到中度敏感，剩余2 種藥物未出現(xiàn)抑菌圈，判定為不敏感（圖1）。隔離池3 種藥物均未出現(xiàn)抑菌圈，判定為3 種抗生素均不敏感（圖2）。

圖1 展出池藥敏試驗結果

圖2 隔離池藥敏試驗結果

2.6 飼養(yǎng)水體水質檢測

4 組水樣水質檢測結果見表4，根據(jù)《地表水環(huán)境質量標準GB 3838-2002》對地表水環(huán)境質量標準基本項目標準限值的要求，1 號、9 號水樣總磷總氮含量為Ⅱ類水質，2 號、4 號水樣總磷總氮含量為Ⅴ類水質，1、2、4、9 號水樣其余4 項指標均為Ⅰ類水質。

表4 水質檢測結果

3 討 論

3.1 救護大鯢入園體況決定其存活率

救護收入的大鯢超過半數(shù)在進園時已經(jīng)有嚴重外傷或者嚴重疾病，表現(xiàn)出體質弱、疾病多、外傷嚴重、進食困難等多種情況。新入園的大鯢中50%以上在入園第1 個月內(nèi)死亡，其中一部分在剛入園時就已經(jīng)處于無法挽救狀態(tài)，而入園體況較好的大鯢存活率較高。

3.2 大鯢生存環(huán)境的菌群情況

根據(jù)水體菌種鑒定和大鯢體表菌種鑒定結果，飼養(yǎng)池和隔離池中分離到的細菌種類有2～3 種，全部為水體常見菌種。只有4 條大鯢體表成功分離到細菌，占所有檢測大鯢的25%。無論是水體中還是大鯢身體表面攜帶的細菌，均屬于單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬這兩大類。這兩屬細菌均為水體中常見的條件致病菌，在大鯢體質較弱或者外傷的情況下會造成大鯢的皮膚潰爛癥狀，引發(fā)大鯢死亡[4]。其中，檸檬酸桿菌菌屬是一種水生動物常見腸道菌群，該屬細菌中只有弗氏檸檬酸桿菌是水生動物的一種常見病原菌[6]。以上幾種鑒定得到的病原菌的種類都不多，基本符合正常水體帶菌情況，因此，對在該水體中生存的大鯢并不會形成嚴重的危害。

通過細菌計數(shù)發(fā)現(xiàn)，展出池細菌數(shù)量少于隔離池。出現(xiàn)這種情況證明人工添加過濾棉網(wǎng)可能并不會減少細菌的數(shù)量，甚至由于過濾棉網(wǎng)使用的時間過長，反而會造成水體中細菌的增加。而展出池中細菌量相對較少，可能是由于水體內(nèi)有少量青苔等地衣類植物，其對營養(yǎng)物質的競爭性爭奪，可能會有一定的抑制細菌過度增長的作用。

由于水產(chǎn)用藥范圍較窄，重慶市動物園長期使用的抗生素藥品只有3 種，通過對水體微生物進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)3 種常用控菌藥物只有黃粉仍有較低的抑菌作用，而另外2 種已經(jīng)無法控制水體內(nèi)的微生物，因此尋找和更換更加有效的藥物成為當務之急。

3.3 大鯢飼養(yǎng)水體水質檢測分析

有機物污染是水體中最容易出現(xiàn)的污染物質，許多有機污染物可在水體被底泥吸附而沉積下來，在今后若干年內(nèi)對水生生物造成持久的毒害作用，而富營養(yǎng)化也是水體中較為常見的水質污染現(xiàn)象，會導致水生態(tài)系統(tǒng)物種分布失衡，單一物種瘋長，破壞了系統(tǒng)的物質與能量的流動，使整個水生態(tài)系統(tǒng)逐漸走向滅亡。根據(jù)《地表水環(huán)境質量標準GB3838-2002》對地表水環(huán)境質量標準基本項目標準限值的要求，重慶市動物園大鯢飼養(yǎng)池的水質富營養(yǎng)化較為嚴重，但是水體并未被有機物污染，重慶市動物園部分隔離池水體氮磷總量皆超標，已經(jīng)為Ⅴ類水質的標準，遠遠高于重慶市其他公園中景觀水體的氮磷總量[7]，但是化學需氧量和高猛酸鹽指標均為Ⅰ類水質的標準。造成這種情況的原因可能是由于重慶市動物園的飼養(yǎng)池隔離池均為封閉式水體，且大部分水體尤其是隔離池的飼養(yǎng)密度較大、水體相對較小，這種結構更容易導致營養(yǎng)富集，雖然水質并未受到有機物污染，但是過高的富營養(yǎng)化程度導致水體內(nèi)各種微生物繁殖加快，增加了大鯢感染病菌的可能性。