楊陽 米文娟田超永林穎查定軍

慶大霉素的耳毒性與包括感覺毛細胞在內的內耳細胞的氧化損傷密切相關。慶大霉素誘導的耳毒性通常被認為是由活性氧(ROS)介導的，ROS的過量產(chǎn)生觸發(fā)細胞凋亡的信號轉導途徑，導致內耳損傷[1]。研究表明耳蝸底回比頂回更易受到損傷[2]，據(jù)報道，由于頂回的外毛細胞中谷胱甘肽的含量降低，耳蝸頂回更能抵抗氧化損傷(Sha,2001)；此外，最近一項利用吸液管技術、RNA-seq和全基因組轉錄分析成年小鼠耳蝸內毛細胞中基因表達的研究發(fā)現(xiàn)，頂回和底回間的基因表達存在差異[3]；這些發(fā)現(xiàn)表明，沿縱向耳蝸軸的基因差異表達模式會導致對自由基敏感性或對氧化應激耐受性的差異。當前，關于慶大霉素誘導的主要氧化損傷相關基因的研究尚無共識，為了充分定量和表征慶大霉素引起的內耳氧化損傷所涉及的主要基因，本研究使用RT2ProfilerTMPCR Array評估慶大霉素損傷后大鼠耳蝸基底膜頂、中和底回的基因表達變化，旨在篩選開發(fā)防治藥物性聾的候選基因。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用出生2天(P2)發(fā)育正常的SD大鼠15只，雌雄不拘，實驗動物來自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。實驗方法均已得到空軍軍醫(yī)大學動物飼養(yǎng)和使用委員會批準。

1.2耳蝸基底膜分離及分組培養(yǎng) 新生大鼠剪開顱腔，去除腦組織，分離雙側顳骨，顯微鏡下取出完整基底膜，鋪在預先制備好的膠原凝膠上，加入SFM培養(yǎng)液，膠原凝膠和培養(yǎng)液的制備參考前期文獻報道的制備方法[4]。將基底膜移入溫度恒定在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時后，分為實驗組和對照組，每組15條基底膜。實驗組在培養(yǎng)液中加入終濃度為0.6 mM的慶大霉素(E003632-1G，Sigma-Aldrich)繼續(xù)培養(yǎng)24小時，對照組在培養(yǎng)液中加入等量的PBS培養(yǎng)24小時。

1.3免疫熒光染色觀察毛細胞 參照有關文獻[5]，培養(yǎng)后每組取5條基底膜，在4°C下用4%多聚甲醛固定8 h，在含1%Triton X-100(V900502，Sigma-Aldrich)和5%牛血清溶液的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中封閉1小時；將組織標本與兔來源的抗肌球蛋白Myosin VIIa一抗(1∶800，Proteus Bioscience，Ramona，CA，USA)在4°C過夜孵育； 用1×PBS洗滌四次后，加入驢抗兔二抗(1∶200，Millipore)在25°C下處理12 h；使用4'，6'-二’基-2-苯基吲哚(DAPI，1∶1 000，Sigma-Aldrich)進行復染。在激光共聚焦顯微鏡下(Nikon)觀察拍照，觀察記錄各回毛細胞形態(tài)。

1.4毛細胞計數(shù) 使用NIS-Elements Viewer 3.20.02軟件分別統(tǒng)計兩組基底膜頂、中和底回單位長度(100 μm)內的毛細胞數(shù)量。

1.5RT2ProfilerTMPCR Array檢測相關基因表達 將培養(yǎng)后的兩組基底膜每組10條分別分成頂回、中回和底回各三組，使用RNeasy Micro Kit(74004，QIAGEN)提取總RNA，使用1 μg總RNA進行逆轉錄(205411，QIAGEN)。使用RT2ProfilerTMPCR陣列試劑盒(PARN-065ZC，QIAGEN)檢測六組樣本中84個氧化損傷相關基因表達的變化[6]; 進行三組重復實驗。

根據(jù)循環(huán)閾值(Ct)值，將數(shù)據(jù)上傳至RT2ProfilerTMPCR Array數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(https://geneglobe.qiagen.com/cn/analyze/)，根據(jù)軟件說明，本研究中Ct值設置為35，使用2-ΔCt計算比較每組對應基因表達差異。選擇“從全面板自動篩選”的方式進行歸一化來進行數(shù)據(jù)處理分析。P<0.05 且表達差異在2倍以上為具有生物學意義的差異表達基因，并以表格的形式呈現(xiàn)基因上調或下調倍數(shù)以及P值。

1.6RT-PCR驗證侯選基因 利用 RT-PCR試劑盒(208054，QIAGEN)驗證篩選出的侯選基因Hmox1的表達量變化。取材后，將培養(yǎng)后的兩組基底膜分別分成頂回、中回和底回各三組，提取RNA和逆轉錄方法同上。Hmox-1正向引物5’-TTTCACCTTCCCGAGCATC-3’，反向引物5’-TCTTAGCCTCTTCTGTCACCCT-3’；β-actin正向引物5’-GAAGAGCTATGAGCTGCCTGA-3’，反向引物5’-TGATCCACATCTGCTGGAAGG-3’。程序設定：95°C 10分鐘，95°C 15秒，60°C 60秒，40個循環(huán)。

1.7GO功能注釋 使用DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)在線分析平臺，對篩選得到的差異基因在基因本體(geneontology，GO)中注釋，以判定差異基因主要影響的生物學功能及其相互聯(lián)系和作用，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.8蛋白互作網(wǎng)絡的構建 通過STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫V11.0 (https://string-db.org/)分析差異表達基因的蛋白互作關系[7]，并以此來構建蛋白互作網(wǎng)絡。

1.9統(tǒng)計學方法 根據(jù)循環(huán)閾值(Ct)值，將數(shù)據(jù)上傳至RT2ProfilerTMPCR Array數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(https://geneglobe.qiagen.com/cn/analyze/)，進行數(shù)據(jù)處理分析；使用SPSS 26軟件和GraphPad 5.01軟件進行數(shù)據(jù)分析，單向方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1免疫熒光染色觀察耳蝸頂、中和底回的損傷差異 對照組基底膜中的三排外毛細胞和一排內毛細胞排列整齊，實驗組毛細胞排列紊亂和細胞丟失(圖1)。細胞計數(shù)顯示，實驗組基底膜的損傷從頂回至底回顯著增加(表1)。

表1 實驗組與對照組各回毛細胞計數(shù)(個)(n=5)

2.2實驗組和對照組耳蝸頂、中和底回氧化損傷相關基因差異性表達比較 通過RT2ProfilerTMPCR Array數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站得出的數(shù)據(jù)，篩選出差異倍數(shù)大于等于2、且P值小于等于0.05的基因。利用火山圖分別比較了兩組耳蝸不同位置之間的基因表達(圖2)。與對照組相比，實驗組頂回共有14個基因表達有生物學意義，其中有12個基因表達上調，2個基因表達下調(表2)；中回共有 19個基因表達有生物學意義，其中有5個基因表達上調，14個基因表達下調(表3)；底回共有10個基因表達有生物學意義，其中有5個基因表達上調，5個基因表達下調(表4)。其中，Hmox1、Ptgs2、Apoe、Gpx6四個基因差異倍數(shù)沿耳蝸縱軸逐漸減小(表5)。

2.3差異表達基因GO分析和蛋白互作網(wǎng)絡結果GO功能注釋的結果表明，與底回相比，頂回和中回差異表達基因在分子功能、生物過程及細胞組成的分布存在差異。顯著富集GO 結果顯示，頂回和中回差異表達基因主要富集在蛋白質均二聚活性和血紅素結合的分子功能上，同時也富集于細胞氧化劑排毒、細胞對缺氧的反應、鐵離子體內平衡和平滑肌細胞增殖的正向調控等生物過程，而底回的差異表達基因并未富集在這些功能上(圖3a、b、c)。構建STRING蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡以評估差異表達基因之間的可能相互作用，蛋白互作分析顯示Hmox1是具有最高連接度的關鍵基因，與9個基因相互作用(圖3d)。結合沿頂、中和底回縱向耳蝸軸差異倍數(shù)變化規(guī)律及蛋白相互作用關聯(lián)度，篩選出Hmox1作為候選基因，進行差異表達驗證。

表2 氧化損傷相關基因在慶大霉素誘導后耳蝸頂回表達的差異倍數(shù)

表3 氧化損傷相關基因在慶大霉素誘導后耳蝸中回表達的差異倍數(shù)

表4 氧化損傷相關基因在慶大霉素誘導后耳蝸底回表達的差異倍數(shù)

表5 Hmonl、Ptgs2、Apoe、Gpx6基因沿耳蝸縱軸在頂、中、底回差異性表達倍數(shù)

2.4Hmox1基因表達差異驗證 利用RT-PCR驗證Hmox1基因在慶大霉素損傷前后在基底膜頂、中和底回表達量的變化，結果顯示，與對照組相比，實驗組頂回Hmox1的mRNA表達量上調9.91倍，中回Hmox1的mRNA表達量上調8.15倍，底回Hmox1的mRNA表達量上調2.49倍。RT-PCR驗證結果與RT2ProfilerTMPCR Array結果的趨勢相同，表達差異倍數(shù)從頂回到底回逐漸降低。

3 討論

大量研究表明，氧化損傷是氨基糖苷類藥物誘導毛細胞死亡的關鍵原因之一，抗氧化劑能夠抑制慶大霉素誘導的內耳損傷[8]。慶大霉素與游離鐵形成氧化還原絡合物，可以催化ROS的形成，ROS的過量產(chǎn)生觸發(fā)細胞凋亡的信號轉導途徑，導致內耳損傷。研究證明在慶大霉素誘導的聽力損失模型中，頂回中的毛細胞比底回的毛細胞對慶大霉素的耐受性更強[2]，據(jù)報道，NAPOH oxidase 2(NOX2)在底回處高表達，導致大量的活性氧產(chǎn)生，使底回的外毛細胞凋亡增加[9]。為了充分定量和表征慶大霉素耳毒性后氧化損傷所涉及的主要基因，本研究使用RT2ProfilerTMPCR分析了基底膜頂回、中回和底回在慶大霉素損傷前后氧化損傷相關基因表達量的變化，旨在尋找內耳細胞在慶大霉素損傷過程中具有關鍵功能的基因。

RT2ProfilerTMPCR分析顯示，與對照組相比，基底膜在慶大霉素損傷后，Hmox1表達量在頂回上調6.84倍，中回上調2.79倍，底回上調2.71倍，上調倍數(shù)呈現(xiàn)從頂回至底回逐漸下降的趨勢。提示慶大霉素對毛細胞由頂回至底回的損傷差異可能是由于Hmox1表達上調倍數(shù)差異造成的。推測頂回Hmox1表達上調倍數(shù)高，毛細胞受到慶大霉素的氧化損傷程度較小，底回Hmox1表達上調倍數(shù)相對較低，因此底回受慶大霉素誘導死亡的毛細胞較多。根據(jù)Hmox1有規(guī)律的表達量差異及相對復雜的互作關系網(wǎng)絡，本研究將它作為潛在的候選基因。Hmox1(Heme Oxygenase 1)血紅素加氧酶屬于血紅素加氧酶家族，作為血紅素分解代謝中的必須酶，分解血紅素產(chǎn)生膽綠素、游離鐵和一氧化碳。Hmox1是細胞在應激反應中的重要蛋白，也是一種熱休克蛋白，可以被熱激、高氧、低氧等誘導; Hmox1廣泛存在于腎、肝、肺等包括內耳在內的其他器官中。Hmox1的藥理學誘導在許多組織的損傷中都有保護作用，包括腦外傷和肝臟缺血再灌注損傷[10];先前的研究還報道了Hmox1位于耳蝸中，并在熱激后表達上調[11];有證據(jù)表明，Hmox1的誘導可防止順鉑誘導的HEI-OC1死亡(Kim,2006)；還有研究表明，Hmox1誘導可保護新生大鼠Corti外植體免受順鉑誘導的毛細胞死亡[12]。這也證實了本研究關于Hmox1通過上調其表達量來保護毛細胞免受慶大霉素的損傷的推測，推測這種保護作用機制可能是：①Hmox1分解代謝產(chǎn)物一氧化碳和膽紅素，其中，一氧化碳在其他系統(tǒng)中能夠抑制某些促炎細胞因子(如TNF-α、IL - 1β)和趨化因子的表達，上調抗炎細胞因子IL10的表達，并抑制細胞的凋亡(Soares,2004)，因此，一氧化碳在內耳毛細胞中可能與某些炎癥因子有關，通過對其表達量的調控抑制細胞死亡；膽紅素作為一種能夠清除過氧自由基并抑制脂質過氧化的抗氧化劑[13]，也可能通過下調內耳中的 ROS從而抑制毛細胞凋亡。②Hmox1能夠調控Nrf2信號通路。有研究表明Hmox1的上調能夠促進Nrf2入核，從而激活Nrf2信號通路[14]，Nrf2是氧化應激中最重要的轉錄因子，參與細胞的多種防御機制，可以對抗各種內在和外在的損傷，在增強組織抗氧化能力、抗腫瘤、抗炎癥、抗凋亡及免受毒物損害中發(fā)揮著重要的作用。因此，推測Hmox1也可能是通過上調其在內耳中的表達，激活Nrf2信號通路，從而激活下游抗氧化劑和細胞保護蛋白。

Ptgs2基因編碼誘導型環(huán)氧合酶COX-2，是催化花生四烯酸合成前列腺素家族的關鍵酶，在各種細胞中可被促炎細胞因子、腫瘤促進劑等高度誘導，從而參與炎癥反應、氧化應激等多種病理過程[15]。COX-2在正常組織中表達量少，在細胞受到脂多糖、細胞內毒素、ROS等刺激的情況下可誘導表達。COX-2在急性肺損傷模型中通過TLR4/ NF-κB/Cox2信號通路引發(fā)氧化應激反應[16]。在砷介導的人尿道上皮細胞系(SV-HUC-1)的氧化損傷過程中，COX-2參與ROS誘導的MAPK通路[17]。本研究篩選結果得出，基底膜在慶大霉素損傷后，與對照組相比，Ptgs2表達量在頂回上調4.65倍，中回上調2.75倍，底回上調2.73倍，上調倍數(shù)呈現(xiàn)從頂回至底回逐漸下降的趨勢，提示慶大霉素對毛細胞由頂回至底回的損傷差異也可能是由于Ptgs2表達上調倍數(shù)差異造成的；推測該基因在損傷過程中起到了某種作用。然而，COX-2在慶大霉素損傷過程中是否參與了對毛細胞的保護作用尚未有研究報道，將在今后的研究中深入探討。

本研究還顯示，基底膜在慶大霉素損傷后，與對照組相比，ApoE基因表達量在頂回、中回和底回分別上調3.62倍、3.39倍和2.33倍，上調倍數(shù)呈現(xiàn)從頂回至底回逐漸下降的趨勢，提示ApoE在頂回毛細胞對慶大霉素更強的耐受性方面可能也發(fā)揮了一定的作用。ApoE編碼載脂蛋白E，具有脂質轉運、抗炎和免疫調節(jié)等功能，阿爾茨海默病患者死亡后尸檢顯示，ApoE與腦內增加的脂質過氧化和升高的血羥自由基密切相關[18]。ApoE參與TNF-α/NF-κB信號通路，內源性ApoE能降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應和氧化應激反應程度，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[19]。上述證據(jù)表明，ApoE 在內耳中的上調也可能起到保護耳蝸毛細胞氧化損傷的作用，深入研究ApoE在慶大霉素損傷過程中的保護作用具有臨床意義。

谷胱甘肽過氧化物酶(GPxs)蛋白家族在清除細胞內生物膜中的磷脂氫過氧化物和過氧化氫方面起主要作用，被認為是抗氧化應激的重要保護者。研究顯示，GPx6蛋白參與抗氧化應激通路，在豬精子體外獲能和頂體反應中發(fā)揮重要作用[20]。體外培養(yǎng)中國倉鼠卵巢細胞顯示，GPX5能夠保護細胞免受氧化應激誘導的脂質過氧化和DNA突變[21]。一項關于老年性聾的研究報道顯示，隨著年齡增加Gpx6基因表達量上調，推測其在老年性聾中起到保護作用[22]。從本研究結果看，基底膜受慶大霉素損傷后，與對照組相比，GPxs表達量在頂回上調3.08倍，中回上調2.24倍，底回上調2.19倍，上調倍數(shù)從頂回至底回逐漸下降的趨勢與毛細胞從頂回至底回逐漸加重的趨勢呈負相關。推測，與中回和底回相比，基底膜頂回受慶大霉素損傷后毛細胞存活數(shù)量更多可能是通過GPxs上調其表達量來實現(xiàn)的。然而，GPxs在抗氧化過程中的分子機制尚不明確，對藥物性聾的保護更是缺乏，值得進行深入研究。

總之，本研究通過RT2ProfilerTMPCR分析了大鼠耳蝸基底膜頂回、中回和底回在慶大霉素損傷前后氧化損傷相關基因表達量的變化，挖掘出一些以前未被識別的在慶大霉素損傷過程中具有關鍵功能的基因；Hmox1作為潛在候選基因，將在未來的實驗中進行深入研究，為藥物性聾的防治提供新的理論依據(jù)。