徐冰 王采集 陳敏 李宛桐 張世麗 趙澤祺 喬月華

近年來，多項(xiàng)研究[1～4]表明，咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease,LPRD)與分泌性中耳炎(SOM)之間存在相關(guān)性，SOM多伴隨LPRD。國內(nèi)[5,6]、國外[7,8]的研究者們在SOM中耳積液中檢測到了胃蛋白酶，且濃度是血清中濃度的百倍，推測胃蛋白酶可能來源于咽喉反流性疾病。目前，LPRD加重SOM的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，主流學(xué)說有中耳負(fù)壓學(xué)說[9]、感染學(xué)說[10]、細(xì)胞因子學(xué)說[11]等。LPRD的反流物包括胃蛋白酶、胃酸、膽汁酸和胰酶等，胃蛋白酶僅在pH酸性的環(huán)境下才具有活性[12]，而胰蛋白酶最適pH值在7.8～8.5，在強(qiáng)酸環(huán)境中幾乎不失活；中耳腔為中性環(huán)境，理論上，在中耳腔，胰蛋白酶比胃蛋白酶更容易發(fā)揮作用，造成粘膜損傷；然而，尚無研究檢測SOM中耳積液中是否存在消化作用更強(qiáng)的胰蛋白酶。反流癥狀指數(shù)評分量表(reflux symptom index, RSI)為臨床診斷LPRD最常采用的手段[13]。故本研究使用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot, WB)驗(yàn)證SOM患者中耳積液中是否存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)一步檢測其濃度；并對SOM患者進(jìn)行RSI量表評估，初步探討成人分泌性中耳炎的中耳積液中是否存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，并分析其在SOM合并LPRD診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對象 以2019年1月～2020年1月經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科確診的40例單側(cè)SOM患者為研究對象，年齡25～60歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有受試者均接受純音測聽、聲導(dǎo)抗、耳鏡檢查以及中耳積液細(xì)菌培養(yǎng)，鼓室導(dǎo)抗圖為B型，耳內(nèi)鏡下見鼓室積液征，且中耳積液細(xì)菌培養(yǎng)3天結(jié)果為陰性，診斷為單側(cè)SOM。排除標(biāo)準(zhǔn)：中耳積液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽性、2周內(nèi)服用過抑酸藥物，有胰腺炎、慢性化膿性中耳炎、鼓膜穿孔、耳部腫瘤、鼻咽癌等疾病者。

1.2中耳積液標(biāo)本采集和pH值測試 所有對象均抽取患耳中耳積液，方法：患耳朝向術(shù)者，清理外耳道，外耳道用75%乙醇消毒。將浸有1%的丁卡因的薄棉片仔細(xì)地貼敷在外耳道皮膚及鼓膜上，保持10分鐘。以7號(hào)針頭于鼓膜前下象限做穿刺，緩慢抽吸鼓室積液，迅速取一部分進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和pH值測試，剩余部分置于2 ml無菌凍存管內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB)及酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA) WB驗(yàn)證中耳積液中是否存在胰蛋白酶與胃蛋白酶，ELISA進(jìn)一步檢測樣本中胰蛋白酶與胃蛋白酶濃度。

WB：抗體購自中國上海-Abcam公司。離心管預(yù)冷，樣品解凍后，取部分樣本至預(yù)冷離心管內(nèi)，加入蛋白酶抑制劑及裂解液，于冰上裂解半小時(shí)。離心(12 000 r/min，4℃，5 min)后取上清至新的預(yù)冷無菌管內(nèi)，加入loading buffer，混勻，100 ℃煮沸10 min；將制作好的樣品加入樣品孔，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及顯影。

ELISA：ELISA試劑盒購自中國武漢-武漢云克隆科技股份有限公司。按照ELISA試劑盒說明書，樣品加入樣品孔后，37℃溫箱孵育1小時(shí)，然后加入顯色劑顯色，終止液終止反應(yīng)，依序測量各孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計(jì)算樣品中胃蛋白酶及胰蛋白酶濃度。

1.4RSI量表評估和填寫基本情況調(diào)查表 所有受試者均需完成基本情況調(diào)查表填寫和反流癥狀指數(shù)評分量表(reflux symptom index, RSI)評估?；厩闆r表包括患者年齡、性別、病程，近期藥物使用情況、既往史等?；颊邔SI量表中的每項(xiàng)癥狀嚴(yán)重程度進(jìn)行自我評分，為盡量減少主觀因素影響，指引填寫的醫(yī)師為同一人；RSI評分>13分為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)及25%、75%四分位數(shù)(QL，QU)表示，樣本間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取0.05。

2 結(jié)果

2.1WB結(jié)果(圖1) 40份單側(cè)SOM患者的中耳積液樣本中，24份(60.0%)檢測到胰蛋白酶，在這24份樣本中，100%(24/24)同時(shí)檢測到了胃蛋白酶。31份樣本中(77.50%)檢測到胃蛋白酶，其中，77.42%(24/31)同時(shí)檢測到胰蛋白酶。

2.2ELISA結(jié)果 24份胰蛋白酶陽性的中耳積液樣本進(jìn)行胰蛋白酶ELISA檢測，31份胃蛋白酶陽性的中耳積液樣本進(jìn)行胃蛋白酶ELISA檢測，結(jié)果經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，均為非正態(tài)分布，故以中位數(shù)及四分位數(shù)(QL，QU)表示。

24份胰蛋白酶陽性的中耳積液樣本中，胰蛋白酶濃度為270.81(201.02，377.56)ng/mL，范圍為62.16～965.64 ng/mL；31份胃蛋白酶陽性的中耳積液樣本中，胃蛋白酶濃度為65.28(59.29，80.82)ng/mL，范圍49.39～134.68 ng/mL，胃蛋白酶濃度顯著低于胰蛋白酶濃度(P<0.0001)。

2.3pH值檢測結(jié)果 40份中耳積液pH值為6.2～8.3，平均7.15±0.61。

2.4RSI量表評估結(jié)果 40例單側(cè)SOM患者中，12例(30.0%)RSI評分為陽性，其中83.33%(10/12)中耳積液樣本中檢測到胰蛋白酶，100%(12/12)樣本中檢測到胃蛋白酶。RSI量表陽性患者樣本中胰蛋白酶和胃蛋白酶檢測陽性率及濃度，與總體樣本之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

研究者[5～8]在SOM患者的中耳積液中檢測到了胃蛋白酶原或胃蛋白酶，推測SOM患者中耳積液中的胃蛋白酶可能來自于LPRD。本研究結(jié)果顯示，除了胃蛋白酶以外，部分SOM患者的中耳積液中還檢出了胰蛋白酶；而且，在胰蛋白酶陽性的樣本中，同時(shí)都檢測到了胃蛋白酶；反之，只有部分胃蛋白酶陽性的樣本中檢測到了胰蛋白酶?？紤]原因是胰蛋白酶存在于胰液中，主要分布在小腸，胃蛋白酶存在于胃液中；LPRD反流物主要為胃內(nèi)容物，含有胃酸和部分胃蛋白酶，可能攜帶或未攜帶緊鄰的十二指腸中的胰液。

本研究結(jié)果中RSI量表陽性的12例樣本中，胰蛋白酶與胃蛋白酶的陽性率和濃度與總體樣本無顯著性差異(P>0.05)，有可能需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步觀察分析；但說明部分SOM合并LPRD的患者未表現(xiàn)出LPRD臨床癥狀，這也與其他學(xué)者研究結(jié)果相符(Hogan,2000;Lieu,2005)。WB結(jié)果顯示，40例SOM患者中24例(60.0%)樣本檢測到胰蛋白酶，31例(77.50%)樣本檢測到胃蛋白酶，考慮合并LPRD，而其中僅有12例(30.0%)RSI量表評分為陽性，即表現(xiàn)出LPRD的臨床癥狀。故可能有部分合并LPRD患者，由于缺乏臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致漏診LPRD。對于這部分患者，在取出中耳積液的同時(shí)，可進(jìn)行胰蛋白酶、胃蛋白酶的檢測，以明確LPRD診斷，早期進(jìn)行抑酸治療。

胰蛋白酶的最適pH值為7～8，胃蛋白酶的最適pH值為1.8～3.5，且當(dāng)pH值超過5時(shí)，胃蛋白酶完全失活[13]；本研究40份中耳積液pH為7.15±0.61，更接近于胰蛋白酶的最適pH值。ELISA結(jié)果表明，24份胰蛋白酶陽性的中耳積液樣本中，胰蛋白酶濃度為270.81 ng/mL，31份胃蛋白酶陽性的中耳積液樣本中，胃蛋白酶濃度為65.28 ng/mL，胃蛋白酶濃度顯著低于胰蛋白酶濃度(P<0.0001)，進(jìn)一步說明中耳腔的pH環(huán)境更適合胰蛋白酶，此環(huán)境中，已被激活的胰蛋白酶可進(jìn)一步激活胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶從而被檢測到，而胃蛋白酶原則會(huì)進(jìn)入失活狀態(tài)[12]。但本研究樣本量較少，此結(jié)論還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。