儲曉琴，徐宇航，祝 旗，鄭峙云

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院；2.安徽省中醫(yī)藥科學院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012)

培麥倫TR-1作為一種新型藥用材料由于它特殊的化學結構，能夠在水包油乳劑中起主要乳化劑的作用[1]。目前已經(jīng)被應用于多方面：ShahinM[2]等通過對制備的不同克霉唑乳狀凝膠的流變性能、短期和長期穩(wěn)定性進行評價，培麥倫TR-1和TR-2能夠使克霉唑顯示出良好的穩(wěn)定性和較高的釋放率；DeLimaJA[3]等制備含克霉唑陽離子納米膠囊的復合培麥倫TR-1水凝膠，結果顯示有較好的鋪展性以及與陰道的兼容性。水楊酸甲酯(Methyl salicylate,MeSA)又被稱為“冬青油”，可由常綠喬木冬青樹的葉子經(jīng)乙醇提取后蒸餾或可由水楊酸與甲醇在硫酸催化下酯化反應合成制得[4]。廣泛用于香料和生物防治中，在醫(yī)藥領域也具廣闊的開發(fā)前景：既可以解熱鎮(zhèn)痛，同時還具有抗菌消炎等作用[5]，屬非甾體抗炎藥。但MeSA穩(wěn)定性較低，易水解成水楊酸[6]。若使用不當，偶見皮膚刺激如燒灼感，或過敏反應如皮疹、瘙癢等[7]。本實驗使用TR-1為新型乳化劑，用水楊酸甲酯為模型藥，探究其制備水楊酸甲酯軟膏的最佳工藝和處方，進一步明確TR-1在構建經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)的作用特點。

1 材料

1.1 儀器EssentiaLC-16高效液相色譜儀(日本島津)，TG16-WS高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(常州普天儀器制造有限公司)。

1.2 試劑MeSA原料藥(華陰市錦前程藥業(yè)有限公司，批號：20170321)，黃原膠(阿拉丁試劑有限公司，批號：G104873)，培麥倫TR-1(杭州卡波卡進出口有限公司，批號：66018001/5)，三乙醇胺(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170516)，硬脂酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20161109)，迷迭香精油(廣州市于楠生物科技有限公司，批號：20181123)，復方水楊酸甲酯軟膏(曼秀雷敦中國藥業(yè)有限公司，批號：H10960282)，PBS緩沖液(博士德生物工程有限公司，批號：20190416)。

1.3 實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20) g，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，本實驗通過倫理學審查。

2 方法與結果

2.1 HPLC方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：phenomenex C18色譜柱(250 nm×4.60 mm，5 μm)；流動相：水相：水：四氫呋喃：磷酸(50∶1∶0.01，v/v)、有機相：乙腈，二元高壓梯度；檢測波長：290 nm；總流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 標準品溶液制備 精密稱取MeSA標準品5 mg，加入乙腈超聲溶解，轉移至50 mL量瓶中，定容，即得100 μg/mL MeSA標準品儲備液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取MeSA軟膏5 mg，加入乙腈超聲溶解，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。精密稱取不含藥的空白軟膏適量，按“2.1.3”項下操作，即得陰性對照溶液制備。

2.1.4 標準曲線及線性范圍 以峰面積A為縱坐標(Y)，溶液濃度C為橫坐標(X)進行線性回歸，得水楊酸甲酯回歸方程：Y=20600X-421.58(R2=0.9994)，結果表明，水楊酸甲酯在1～50 μg/mL濃度范圍內關系良好。

2.1.5 系統(tǒng)適用性考察 分別取適量陰性對照溶液、供試品溶液和MeSA標準品溶液，按照“2.1.1”項下測定。結果顯示，供試品溶液在對照品相對應位置有色譜峰，陰性對照溶液不干擾主峰的測定，分離度大于1.5。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液，每隔2 h進樣一次，重復進樣6次。峰面積的RSD為1.18%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.1.7 精密度考察 精密吸取“2.1.2”項下MeSA標準品溶液，連續(xù)進樣6次。峰面積RSD為1.02%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復性考察 按“2.1.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，進樣測定，峰面積RSD為1.42%，表明方法重復性良好。

2.1.9 回收率實驗 精密稱取適量MeSA對照品，添加至空白軟膏中，按“2.1.4”項下方法制備質量分數(shù)分別為8%、10%、12%的MeSA軟膏。結果顯示，平均回收率為98.90%，RSD為1.11%，回收率良好。

2.2 軟膏的評價指標以藥物含量、離心穩(wěn)定性和pH值作為軟膏的評價指標[8-11]。藥物含量按“2.1.3”項下操作，HPLC進樣測定。稱取1 g樣品置于1.5 mL離心管中，在4000 r/min轉速下離心15 min，取出后觀察，是否出現(xiàn)油水分層、變軟、液化或硬化等現(xiàn)象。無現(xiàn)象得5分；略有分層得4分；變軟得3分；液化得2分；硬化得1分。稱取樣品100 mg至燒杯中，加入10倍量超純水至完全溶解，搖勻后測定樣品pH值。人體皮膚正常pH值范圍為4.0～6.0，但考慮到水楊酸甲酯軟膏一般用于治療皮膚病，皮膚受損后，pH值會升高，且O/W型乳劑基質的軟膏pH應小于8.3[11]，故參考以pH 6.0～8.0為合格，其余均為不合格。

2.3 水楊酸甲酯軟膏的工藝篩選

2.3.1 水楊酸甲酯軟膏的制備工藝 根據(jù)預實驗及文獻調研，確定基本處方：10%的MeSA、0.5% TR-1、0.5%三乙醇胺、0.2%黃原膠、87%水、2%迷迭香精油。最佳工藝：將適量TR-1均勻散于水上，900 r/min攪拌20 min，滴加三乙醇胺，4 ℃貯存24 h后取出，于80 ℃下預熱備用；取油相成分(MeSA、黃原膠)置于水浴上加熱至80 ℃，熔化混勻后，攪拌下將油相緩慢滴加入水相，乳化5～6 min，轉至室溫攪拌30 s，加入精油攪拌20 min至近冷凝。

2.3.2 乳化操作的影響 考慮到MeSA和TR-1作為乳化劑的性質以及預實驗結果[11]，TR-1在攪拌溶脹下，4 ℃貯存24 h后其乳化性質較佳，成品粘稠度較高，所以將傳統(tǒng)乳化法作為候選方法之一。

方法一：取油相成分(TR-1、MeSA)置容器中，于水浴上加熱至80 ℃使熔化；取水相成分(水、三乙醇胺、黃原膠)置另一容器中于水浴中亦加熱至80 ℃使其混勻，在攪拌下將水相以細流狀滴入油相，乳化5～6 min，再室溫下攪拌30 s后，加入精油攪拌20 min至近冷凝。方法二：“2.3.1”項下最佳工藝。方法三[11]：將水相緩慢滴入油相中，其余同方法二。方法四：將三乙醇胺加入到足量水中，混勻后將TR-1鋪撒其上，900 r/min攪拌20 min，4 ℃存放24 h后取出預熱80 ℃?zhèn)溆?；后續(xù)操作同方法二。按照方法二，考察乳化溫度對于軟膏性能的影響，三個梯度乳化溫度：60 ℃、70 ℃、80 ℃，分別記為M5，M6，M7。通過以上多種實驗方法優(yōu)選出最佳制備工藝：工藝二溶脹法；最佳乳化溫度：80 ℃。

表1 水楊酸甲酯軟膏的工藝篩選

2.4 水楊酸甲酯軟膏的處方優(yōu)化以外觀性狀表現(xiàn)、離心穩(wěn)定性、pH值、含量為評價指標，按照最佳工藝操作，單因素考察不同軟膏基質、TR-1用量及不同載藥量對軟膏性能的影響，優(yōu)選最佳處方。

2.4.1 增稠劑和TR-1用量的影響 考察不同增稠劑(硬脂酸、液體石蠟)的影響，與方法二比較，分別記為F1、F2、F3?？疾觳煌琓R-1(0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)對軟膏整體性能的影響，分別記為N1，N2，N3，N4，N5。結果見表2。比較F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3可知加入硬脂酸，軟膏離心穩(wěn)定性較差，含量偏低；加入液體石蠟，軟膏離心穩(wěn)定性優(yōu)，但含量偏低。綜合考慮，不加增稠劑比較好。乳化劑含量增加到0.8%以上時，其外觀以及離心穩(wěn)定性表現(xiàn)良好，結合成本，優(yōu)選TR-1含量為0.8%。

表2 增稠劑和乳化劑含量的影響

2.4.2 載藥量影響 制備載藥量為10%、12%、14%的MESA軟膏，記為T1、T2、T3。結果如圖1、表3，三個處方性能均較佳，故在10%～14%內調整藥物投放量，對軟膏的綜合性能無影響。

圖1 不同載藥量軟膏外觀圖

表3 載藥量的影響

2.5 體外經(jīng)皮滲透實驗

2.5.1 體外透皮實驗 將預處理的大鼠皮膚固定于改良Franz擴散池中，角質層面向供給池，接受池中注入 pH=6.8的PBS溶液8 mL，排凈氣泡；擴散池內放入0.5 g樣品，分別為市售軟膏和自制水楊酸甲酯10%的軟膏，置透皮擴散試驗儀中，(37.0±0.5) ℃ 恒溫水浴，攪拌轉速為120 r/min，于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h、12 h、24 h 吸取接收液1 mL，并補充相同體積PBS溶液，樣品過0.45 μm 濾膜，續(xù)濾液用 HPLC 法測定含量。

2.5.2 數(shù)據(jù)處理與分析 含量測定后，按照如下計算公式計算累積滲透量(Qn)，以累積滲透量(Qn)對時間(t)進行線性回歸，回歸方程的斜率為滲透速率(Js) ，計算24 h的透過速度和Js。并用統(tǒng)計學方法(統(tǒng)計分組法)對實驗結果進行處理分析。

V表示接收池體積(8 mL)；V0表示取樣體積(1 mL)；S為藥物擴散時的有效透過面積(3.14 cm2)

結果顯示，在相同載藥量下，自制水楊酸甲酯軟膏的體外透皮累積滲透量是市售軟膏的1.70倍，說明TR-1能顯著促進水楊酸甲酯的透皮性能。見圖2、表4。

圖2 加入TR-1的軟膏和市售水楊酸甲酯軟膏的透皮曲線圖

表4 加入TR-1的軟膏和市售水楊酸甲酯軟膏的透皮吸收試驗結果

3 討論

水楊酸甲酯軟膏因其可能會導致不良反應且穩(wěn)定性較差，所以臨床應用得到限制，而TR-1在乳劑系統(tǒng)中的最大優(yōu)點是具有乳化和穩(wěn)定雙重作用，能夠明顯提高藥物穩(wěn)定性及釋放率，且有較高的鋪展性。因此考慮應用TR-1來制備軟膏是提高藥物穩(wěn)定性以及經(jīng)皮給藥的生物利用度的有效手段之一。TR-1對于軟膏劑具有良好的作用，與其分子中存在的親水和疏水部分使其具有乳化作用，且可在較大范圍內調節(jié)兩相黏度有關。本實驗制備的水楊酸甲酯軟膏，透皮性能為市售相同載藥量的水楊酸甲酯復方軟膏的1.70倍。在應用劑型方面，TR-1作為一種優(yōu)良的藥用合成高分子輔料既可作為乳化劑，用于外用O/W型乳劑，也可作為顆粒劑和片劑的黏合劑和在內服或外用液體制劑中增黏等等，因此TR-1的應用價值具有很大的開發(fā)潛能。如果把TR-1具體應用到劑型研究應用上，不僅可以解決某些劑型選擇上的不足，也能極大地提高藥物的生物利用度。