唐亮,唐名艷,潘志新,蔣滿貴,趙燁蕓,余武昌,李標(biāo),虞崇江,董桂清*
(1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站,南寧市 530007;2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院,南寧市 530007)
廣西是全國(guó)蠶桑產(chǎn)業(yè)大?。▍^(qū)),在承接“東桑西移”的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移中,逐漸形成了以小蠶共育及多批次連續(xù)養(yǎng)蠶為特點(diǎn)的廣西高密度養(yǎng)蠶模式,為蠶繭產(chǎn)量提升提供了有力保障,使廣西成為了全國(guó)乃至世界重要的桑蠶繭絲生產(chǎn)基地。但廣西高溫多濕氣候以及連續(xù)養(yǎng)蠶的飼養(yǎng)模式,更易多發(fā)生物病原繁殖與感染從而引發(fā)病害。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),廣西蠶桑生產(chǎn)中由發(fā)生蠶病造成的蠶繭損失15%~20%。
家蠶血液型膿病又稱家蠶核型多角體?。˙ombyx moriNuclearpolyhedrosis Virus NPV,簡(jiǎn)稱BmNPV),是危害家蠶最嚴(yán)重的一種病毒病,僅2008—2018 年廣西家蠶膿病年均發(fā)生率為11.35%,使之成為廣西最為嚴(yán)重的傳染性蠶病之一[1-2],每年損失蠶繭達(dá)數(shù)萬(wàn)噸。其病毒是一種有包涵體的DNA 病毒[3],對(duì)蠶座血液型膿病次生感染進(jìn)行調(diào)查情況,有助于解析家蠶病毒病傳播的關(guān)鍵要素,服務(wù)蠶桑產(chǎn)業(yè)蠶病防控?;诩倚Q血液型膿病對(duì)蠶桑產(chǎn)業(yè)的巨大危害,精準(zhǔn)防控該病成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。王霞等[4]通過(guò)對(duì)廣西不同蠶區(qū)來(lái)源的15 株BmNPV毒株進(jìn)行測(cè)定,其對(duì)家蠶品種兩廣二號(hào)的LC50多角體濃度2.1×106~4.2×106個(gè)/mL,屬于抗性較高水平,但毒株間差異不顯著。在前期蠶病普查研究中發(fā)現(xiàn),廣西河池地區(qū)血液型膿病的發(fā)病率與季節(jié)、蠶區(qū)有緊密的相關(guān)性,如夏季的6—8 月血液型膿病顯著高于其他月份;氣溫高和降雨多的蠶區(qū)血液型膿病年均發(fā)生率高,如貴港蠶區(qū)夏季發(fā)病率為18.15%,危害嚴(yán)重[2]。
偏相關(guān)分析是指當(dāng)兩個(gè)變量同時(shí)與第三個(gè)變量相關(guān)時(shí),將第三個(gè)變量的影響剔除,只分析另外兩個(gè)變量之間相關(guān)程度的過(guò)程,判定指標(biāo)是相關(guān)系數(shù)的R值,是目前使用較多的一種分析工具。影響家蠶血液型膿病的因子較多,對(duì)傳染因子進(jìn)行偏相關(guān)分析可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)防控該病,抓住主要影響因子。韋秉興等[5]2008 年報(bào)道將5%BmNPV 的兩廣二號(hào)病蠶混入不同飼養(yǎng)密度的5齡蠶群體,觀察膿病二次感染的發(fā)生率。結(jié)果顯示,909 頭/m2的飼養(yǎng)密度膿病發(fā)病率高達(dá)68.40%,但其試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,傳染因子種類設(shè)置較少,在蠶座傳染試驗(yàn)設(shè)計(jì)上,混育群體數(shù)量較少,數(shù)據(jù)處理采用回歸統(tǒng)計(jì)分析,未進(jìn)行偏相關(guān)分析。而在絲繭育養(yǎng)蠶過(guò)程中,養(yǎng)蠶群體較大,傳染影響因子較多,氣候、飼育密度、混育病蠶數(shù)等對(duì)發(fā)病率可能有較大影響。
血液型膿病的高發(fā)生率通常被認(rèn)為是病蠶在蠶座中發(fā)生了二次感染導(dǎo)致(也稱次生傳染),但低齡蠶期感染病原形成的次生傳染規(guī)律及防控措施有效性等鮮有報(bào)道。小蠶共育是廣西蠶桑生產(chǎn)中常見的飼育形式,將蠶兒共育至3齡餉食后售賣,3齡第二口葉轉(zhuǎn)由農(nóng)戶飼養(yǎng)。如共育的小蠶存在血液型膿病感染,那么膿病感染率對(duì)大蠶飼養(yǎng)產(chǎn)生何種影響尚未可知?;谝陨蠁?wèn)題,本研究對(duì)不同氣候條件、飼養(yǎng)密度、病蠶比例、藥物處理等血液型膿病傳染因子進(jìn)行調(diào)查分析,為防控家蠶血液型膿病提供理論依據(jù)。
測(cè)試病原來(lái)源于廣西河池蠶區(qū),從發(fā)病膿蠶中分離制備多角體病毒,4.0 ℃保存?zhèn)溆谩9┰嚰倚Q品種為兩廣二號(hào)?;烊氩≡Q的制備方法:分別在混入病蠶前84 h、96 h、108 h 在桑葉上涂抹濃度為5×108個(gè)/mL 病毒多角體并連續(xù)添食,在同期兩廣二號(hào)正常蠶起蠶第二口葉時(shí),挑選出有典型膿病癥狀的病蠶(比如在蠶座中表現(xiàn)狂躁、體色乳白、高節(jié)、亂爬的蠶),用馬克筆標(biāo)記,作為測(cè)試混入源病蠶。Tris、NaCl、EDTA、SDS、TritonX 等試劑為滬試,家蠶核型多角體(RAA)快速檢測(cè)試劑盒由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站及南寧眾測(cè)有限公司聯(lián)合研發(fā)。
在實(shí)驗(yàn)室模擬廣西蠶區(qū)春、夏、秋季的溫濕度氣候環(huán)境,設(shè)置春季(25℃和85%RH)、夏季(33℃和90%RH)、秋季(30℃和80%RH)3 個(gè)處理,設(shè)空白對(duì)照組,每個(gè)處理100頭(供試健康蠶+混入病蠶=100),每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。在三齡起蠶第二口葉各個(gè)處理分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶,混入病蠶30 min后正常喂葉,然后按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)至上蔟,調(diào)查蠶期病死蠶、上蔟后第5 d(化蛹后2 d)死籠率情況。病死蠶核定采用常規(guī)鏡檢復(fù)核和重組酶介導(dǎo)鏈(RAA 法)復(fù)核相結(jié)合的方式,精準(zhǔn)確定血液型膿病次生傳染病蠶數(shù)量。
在實(shí)驗(yàn)室模擬低密度、標(biāo)準(zhǔn)密度、高密度3 個(gè)不同飼養(yǎng)密度,在標(biāo)準(zhǔn)密度基礎(chǔ)上降低33.3%為低密度,在標(biāo)準(zhǔn)密度基礎(chǔ)上提高33.3%即為高密度。根據(jù)地方標(biāo)準(zhǔn)推薦密度作為標(biāo)準(zhǔn)密度,3~5齡3個(gè)齡期飼養(yǎng)密度分別定為8 000 頭/m2、3 500 頭/m2、750 頭/m2,在各齡起蠶第二口葉后設(shè)定為各齡間密度轉(zhuǎn)換節(jié)點(diǎn)。
設(shè)低密度、標(biāo)準(zhǔn)密度、高密度3個(gè)處理,設(shè)空白對(duì)照組。在三齡起蠶第二口葉各個(gè)處理分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶,按照設(shè)定密度條件飼養(yǎng)至上蔟,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和調(diào)查方法參照1.2執(zhí)行。
設(shè)3 齡混入病蠶、4 齡混入病蠶、5 齡混入病蠶3個(gè)處理,設(shè)空白對(duì)照組。3 齡期起蠶第二口按3%、5%、10%比例的混入病蠶。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、飼養(yǎng)和調(diào)查方法參照1.2執(zhí)行。
在實(shí)驗(yàn)室模擬的秋季環(huán)境及標(biāo)準(zhǔn)密度條件下,設(shè)置新鮮石灰粉、“蠶康1 號(hào)”、風(fēng)化石灰粉3 個(gè)藥物處理及陽(yáng)性和空白對(duì)照組。每個(gè)處理100頭(供試健康蠶+混入病蠶=100),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在三齡起蠶第二口葉各個(gè)處理區(qū)分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶,分別用新鮮石灰粉、蠶康1號(hào)、風(fēng)化石灰粉等3種藥物進(jìn)行蠶體蠶座消毒,每天喂蠶前分別進(jìn)行蠶體蠶座消毒1次直至上蔟,陽(yáng)性對(duì)照混入病蠶后不用藥物處理。飼養(yǎng)和調(diào)查方法參照1.2執(zhí)行。
新鮮石灰粉制備:塊狀生石灰與水混合質(zhì)量比約為1.0∶0.8,放置自然冷卻后,將石灰粉過(guò)篩密封備用。
自然風(fēng)化石灰制備:將生石灰暴露于在空氣中,待形成松散的白色粉末,收集備用。
1.6.1 BmNPV鏡檢復(fù)核 將血液型膿病典型癥狀死蠶,加入等質(zhì)量的蒸餾水,用小型勻漿器勻漿,吸取少量勻漿液至載玻片上,用2倍檢測(cè)液體積的50%乙醇處理1 min,制成樣品,16×40 倍光學(xué)顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)病毒多角體,則記錄為病毒再感染蠶體。否則采用RAA 快速檢測(cè)試劑盒(杭州眾測(cè)生物科技有限公司)進(jìn)行檢查復(fù)核。
1.6.2 BmNPV 的RAA 快速檢測(cè)復(fù)核 將未見血液型膿病典型癥狀死蠶,取病死蠶勻漿(方法同1.6.1),加入檢測(cè)液3 倍體積的裂解液(100 mM Tris-HCl pH 8.0,10 mM EDTA pH 8.0,2.0 M NaCl,0.1 M Na2CO3,1%SDS,0.1 mg/mL RnaseA),振蕩混勻,常溫孵育5~8 min 釋放DNA,吸取上清液待用,作為RAA核酸檢測(cè)的DNA樣本。
按照家蠶血液型膿病核酸測(cè)試劑盒(RAA 熒光法)使用說(shuō)明進(jìn)行測(cè)試。每次測(cè)試分別用目標(biāo)基因DNA質(zhì)粒和蒸餾水設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照。
對(duì)測(cè)定所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 的“單因素ANOVA 檢驗(yàn)”進(jìn)行顯著性分析,“偏相關(guān)”進(jìn)行因子相關(guān)性分析。
在不同溫濕度(模擬不同季節(jié))飼養(yǎng)環(huán)境混入不同比例病蠶,蠶期及蛹期第5天血液型膿病發(fā)生結(jié)果(圖1)?;烊?%的病蠶,蠶期發(fā)病率為春季22.68%<秋季29.55%<夏季40.20%,差異達(dá)到極顯著水平;蛹期血液型膿病發(fā)病率也呈春季(25℃和85%)10.65%<秋季(30℃和80%)13.75%<夏季18.90%趨勢(shì),發(fā)病率隨溫濕度升高而增大,其中夏季與春季、秋季的差異均達(dá)到顯著水平?;烊?%、10%的病蠶發(fā)病率也呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)。預(yù)示著在蠶群體中已有個(gè)體被感染情況下,高溫多濕環(huán)境是誘導(dǎo)和加快蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病的重要因子,與實(shí)際生產(chǎn)中6—8月家蠶血液型膿病率高相吻合。
從圖1 還可看出,秋季混入3%、5%、10%不同比例病蠶時(shí),蠶期蠶座內(nèi)次生發(fā)病率分別為29.55%、45.96%、63.33%,差異達(dá)顯著水平;蛹期發(fā)病率也分別達(dá)13.75%、19.65%、19.63%。春季、夏季混入不同比例病蠶發(fā)病率也有類似趨勢(shì),表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強(qiáng)的蠶座內(nèi)群體次生傳染力,混入感染病蠶個(gè)體比例越高,蠶期及蛹期次生傳染發(fā)病越嚴(yán)重。因此,家蠶血液膿病防控應(yīng)重視減少源頭病原的感染與防控。
圖1 不同氣候環(huán)境混入不同比例的蠶座內(nèi)血液型膿病次生傳染率
家蠶不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶,蠶期及蛹期第5 天血液型膿病發(fā)生結(jié)果見(圖2)。混入3%的病蠶,蠶期發(fā)病率呈現(xiàn)低密度25.09%<標(biāo)準(zhǔn)密度29.21%<高密度35.40%趨勢(shì),高密度與標(biāo)準(zhǔn)密度、低密度差異達(dá)到顯著水平;標(biāo)準(zhǔn)密度發(fā)病率雖然高于低密度,但未達(dá)到顯著水平。蛹期發(fā)病率也呈低密度9.28%<標(biāo)準(zhǔn)密度12.37%<高密度15.12%趨勢(shì),發(fā)病率隨密度升高而增加,但差異不顯著。混入5%、10%病蠶發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。該結(jié)果表明家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病與蠶座密度有密切關(guān)系,蠶座密度越大,次生傳染發(fā)病率越高,推測(cè)原因是因?yàn)樾Q頭密度過(guò)高,家蠶食下病毒污染葉的機(jī)會(huì)較大,還有蠶胸、腹足勾爪相互抓傷,增加病毒創(chuàng)傷感染的機(jī)率,同時(shí)蠶頭密度過(guò)高增加健康蠶與病蠶接觸的概率,增加傳染風(fēng)險(xiǎn)。
從圖2還可看出,低密度(標(biāo)準(zhǔn)密度降低33.3%)混入3%、5%、10%不同比例病蠶時(shí),蠶期蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率分別為25.09%、38.60%、54.07%,差異達(dá)顯著水平;蛹期發(fā)病率也分別達(dá)9.28%、12.98%、14.07%,混入10%病蠶與混入3%病蠶的差異達(dá)到顯著水平。標(biāo)準(zhǔn)密度、高密度混入不同比例病蠶其發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。該結(jié)果進(jìn)一步表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強(qiáng)的蠶座傳染,混入感染病蠶個(gè)體越多,蠶期及蛹期次生傳染發(fā)病越嚴(yán)重。
圖2 不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶蠶座中血液型膿病次生傳染率
不同齡期混入不同比例病蠶,蠶期及蛹期第5 d血液型膿病發(fā)生結(jié)果見圖3?;烊?%的病蠶,蠶期發(fā)病率呈現(xiàn)5 齡(11.00%)<4 齡(18.90%)<3 齡29.55%趨勢(shì),差異達(dá)到顯著水平;蛹期發(fā)病率5 齡(4.47%)<4齡(11.00%)<3齡(13.75%),其中3齡混入與5 齡混入的發(fā)病率差異達(dá)到顯著水平?;烊?%、10%的病蠶其發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。預(yù)示著家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病與蠶被感染齡期有密切關(guān)系,被感染齡期越小,次生傳染發(fā)病率越高。
從圖3 還可看出,3 齡期混入3%、5%、10%病蠶時(shí),蠶期蠶座內(nèi)次生發(fā)病率分別為29.55%、45.96%、63.33%,差異達(dá)顯著水平;蛹期發(fā)病率也分別達(dá)13.75%、16.49%、19.63%,其中混入10%病蠶與混入3%病蠶其發(fā)病率差異達(dá)顯著水平。4齡期、5齡期混入不同比例病蠶其發(fā)病率也有類似趨勢(shì)。該結(jié)果進(jìn)一步表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強(qiáng)的蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病,只要有傳染源存在,就會(huì)形成傳播鏈,迅速傳播感染,蠶齡期越小,次生傳染發(fā)病率越高。
圖3 不同齡期混入不同比例病蠶蠶座中血液型膿病累計(jì)發(fā)生曲線
不同藥物處理蠶期及蛹期第5 d 血液型膿病防控效果結(jié)果見圖4。在3 齡混入病蠶后,不同藥物處理的防控效果表現(xiàn)為新鮮石灰粉80.24%>“蠶康1號(hào)”67.44%>自然風(fēng)化石灰粉41.86%,差異達(dá)顯著水平。4齡、5齡混入病蠶后,不同藥物處理也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。該結(jié)果表明防控藥物介入可降低次生傳染發(fā)病率,但不同藥物防控效果不一樣,如本試驗(yàn)中新鮮石灰粉和“蠶康1 號(hào)”兩種藥物均能顯著降低血液型膿病發(fā)病率。
從圖4 還可看出,新鮮石灰粉防控效果,呈現(xiàn)混入3%病蠶(80.24%)>混入5%病蠶(51.91%)>混入10%病蠶(49.12%)的趨勢(shì),差異達(dá)到顯著水平。“蠶康1 號(hào)”、風(fēng)化石灰粉防控效果也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。該結(jié)果表明隨著蠶群體內(nèi)被感染病蠶個(gè)體增加,形成多點(diǎn)不同時(shí)期發(fā)病的多條傳播鏈,如果每天只施用1次的藥物處理,難以有效切斷傳播鏈。因此,在生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)血液型膿病感染發(fā)病后,應(yīng)注意觀察蠶的發(fā)育情況,及時(shí)撿出病死蠶并增加施用藥物次數(shù),以提升防控效果。
圖4 不同病蠶混入、不同藥物處理的蠶座血液型膿病防控效果曲線
利用SPSS 25.0 對(duì)各測(cè)試因素進(jìn)行偏相關(guān)分析,獲得的數(shù)據(jù)顯示(表1),相關(guān)性最高的為“病蠶比例”,為0.603,其次是“混入齡期(時(shí)長(zhǎng))”,為0.393,第三是“藥物處理”,為-0.381,之后是“飼養(yǎng)季節(jié)”,為0.232和“飼養(yǎng)密度”,為0.221。即影響家蠶群體血液型膿病次生感染的首要因素是病蠶混入比例,其次是起始感染齡期,第三是藥物處理。其中前兩者顯著正相關(guān),而藥物處理呈顯著負(fù)相關(guān)。
表1 不同因子與家蠶群體血液型膿病發(fā)病率的偏相關(guān)分析
本研究通過(guò)蠶座中病血液型膿病次生感染情況,探究不同因子對(duì)家蠶“兩廣二號(hào)”發(fā)病情況的影響,明確該病在蠶座中的傳染規(guī)律。
在不同氣候(模擬不同季節(jié)),混入同一比例的病蠶,蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)春季<秋季<夏季的趨勢(shì),差異達(dá)到極顯著水平,在蠶群體內(nèi)已有個(gè)體被感染情況下,高溫多濕環(huán)境是誘導(dǎo)和加快蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病的主要因子,在生產(chǎn)上也得到了證實(shí)[2,4,6]。
在同一氣候環(huán)境下,蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)混入病蠶比例越高發(fā)病率越高的趨勢(shì),差異達(dá)顯著水平。表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強(qiáng)的蠶座內(nèi)群體次生傳染力,混入感染病蠶個(gè)體比例越高,次生傳染發(fā)病越嚴(yán)重,偏相關(guān)分析其與發(fā)病率的相關(guān)系數(shù)最高,表明控制病蠶數(shù)量應(yīng)是血液型膿病早期防控中最重要的環(huán)節(jié)。
不同飼養(yǎng)密度飼養(yǎng)條件下,混入同一比例的病蠶,蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)低密度<標(biāo)準(zhǔn)密度<高密度的趨勢(shì),高密度與標(biāo)準(zhǔn)密度和低密度差異達(dá)到顯著水平,但相關(guān)系數(shù)在所測(cè)影響因子中排名最后。表明家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)群體傳染與蠶座密度有一定關(guān)系,過(guò)密的蠶座使血液型膿病傳染發(fā)病率更加嚴(yán)重,生產(chǎn)上也存在這種趨勢(shì)[5,7]。
不同齡期混入病蠶的試驗(yàn)中,蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)出5 齡<4 齡<3 齡的趨勢(shì),差異達(dá)顯著水平,且偏相關(guān)性分析顯示相關(guān)系數(shù)僅次于病蠶混育率。表明家蠶群體血液型膿病次生傳染發(fā)病率與被感染齡期有密切關(guān)系,齡期越大發(fā)病越少,表明蠶病防控中應(yīng)重視小蠶期的病原清除與隔離,以降低血液型膿病危害。
不同藥物對(duì)病蠶混育率的防控效果有差異,防控效果新鮮石灰粉>蠶康1號(hào)>自然風(fēng)化石灰粉,偏相關(guān)分析差異達(dá)顯著水平,表明防控藥物介入可降低次生傳染發(fā)病率,但不同藥物防控效果不一樣,如本試驗(yàn)中新鮮石灰粉和蠶康1 號(hào)兩種藥物均能顯著降低血液型膿病發(fā)病率[8]。
在相同藥物處理?xiàng)l件下,隨著初始混入病蠶比例增加,防控效果呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),偏相關(guān)分析差異達(dá)到顯著水平,表明隨著蠶群體內(nèi)被感染病蠶個(gè)體比例增加,多點(diǎn)散發(fā)不同時(shí)期發(fā)病的多條傳播鏈,如果每天只施用1次藥物,很難完全有效切斷所有傳播鏈,會(huì)出現(xiàn)病原“逃逸”現(xiàn)象,增加擴(kuò)散傳染的風(fēng)險(xiǎn),所以在藥物防治上,增加施用次數(shù)能夠減輕危害。
通過(guò)對(duì)廣西地區(qū)“兩廣二號(hào)”血液型膿病傳染因子進(jìn)行研究并且首次采用偏相關(guān)分析,認(rèn)為,蠶群體內(nèi)有病蠶,高溫多濕環(huán)境是誘導(dǎo)和加快蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病的主要因子;家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強(qiáng)的蠶座內(nèi)群體次生傳染力,群體中病蠶比例越高,蠶座傳染越嚴(yán)重;蠶座密度越高,次生傳染發(fā)病率隨之提升;家蠶群體血液型膿病次生傳染發(fā)病率與被感染齡期有密切關(guān)系。偏相關(guān)分析結(jié)果顯示,病蠶混育率是最主要的影響因子,其次是混育齡期,第三是使用藥物,第四是飼養(yǎng)季節(jié),最后是飼養(yǎng)密度。每天施用一次藥物仍然會(huì)出現(xiàn)病原逃逸的現(xiàn)象,宜增加施藥次數(shù)減輕危害。