趙慧穎，黃昕艷，李 航，閔 程，鄭勇騏，閆 暢，郭 淼，戚詢中,朱曉峰

(1.佳木斯大學(xué)；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154000；3.伊春市林業(yè)中心醫(yī)院，黑龍江 伊春 153000；4.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154000；5.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦血管病是目前威脅人類健康的重大疾病之一，多發(fā)于中老年人群，且有年輕化趨勢。目前針對此疾病的治療手段較少，尤其對于無法進(jìn)行超早期溶栓治療的患者，現(xiàn)有治療效果仍難以令人滿意。丁基苯酞是我國具有知識產(chǎn)權(quán)的化學(xué)新藥，具有多種藥理作用；既往報道指出，丁基苯酞能夠減輕腦缺血后認(rèn)知障礙[1]，減輕炎癥[2]，具有多種腦保護(hù)作用[3]。于2002年，中國國家食品與藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)其在缺血性腦血管疾病中應(yīng)用[4]，但目前其具體作用機制尚不明確。興奮性氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。腦缺血損傷的機制也涉及興奮性氨基酸，包括谷氨酸的大量堆積即可導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡[5-7]。谷氨酸轉(zhuǎn)運體在維持胞外谷氨酸含量上具有重要作用。有研究證實在體外神經(jīng)元缺氧、復(fù)氧損傷模型中，谷氨酸對損傷神經(jīng)元起保護(hù)作用。此外，大鼠腦皮質(zhì)中EAAT2過表達(dá)，可顯著減少腦缺血導(dǎo)致的谷氨酸外流、細(xì)胞凋亡并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[8]。而PI3K/AKT信號通路能夠改善缺血再灌注后的血腦屏障功能，繼而減輕血管源性腦水腫和恢復(fù)腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[9]。本課題擬觀察丁基苯酞對MCAO大鼠模型的治療作用及對谷氨酸興奮性毒性作用的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響，分析丁基苯酞在缺血性腦血管疾病的治療作用機制，為期臨床機制的闡述提供試驗依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料與試劑RT Master Mix(Takara RR036A)、Premix Ex TaqTMII(Takara RR420L)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天P0010S)、EAAT2(EAAT2) Antibody(博士德PB0293)、EAAT1(EAAT1) Antibody(博士德BA0892-2)、GAPDH Antibody(博士德A00227-1)、丁基苯酞(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè))等。

1.2 實驗動物選用6～7周齡SD雄性大鼠，體重約為250～270 g，實驗動物均購自佳木斯大學(xué)實驗動物中心[合格證號：SYXK(黑)2021-018]，使用無菌木屑做墊料，環(huán)境溫度保持在22～24 ℃，濕度保持45%～55%，使用每天12 h制的明/暗周期，并為其提供足夠的食物和飲用水。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗，實驗動物采取單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。動物實驗操作符合動物管理及保護(hù)規(guī)定，符合倫理學(xué)要求。

1.3 腦缺血模型建立、分組及評估采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為三組，每組實驗動物15只：Sham組(假手術(shù)組：不行大腦中動脈阻塞操作)、MCAO組(采用Longa線栓法構(gòu)建大腦中動脈阻塞模型[10])及NBP組[采用Longa線栓法構(gòu)建大腦中動脈阻塞模型，造模完成后第二天給予丁基苯酞灌胃，溶劑為花生油(100 mg/kg，該濃度參照于一個NBP對局灶性腦缺血模型神經(jīng)保護(hù)的研究中使用的濃度[11])，1次/d，持續(xù)7 d]；Sham組及MCAO組同時給予等體積溶劑灌胃；采用Zea Longa5等級評分法對Sham組、MCAO組、NBP組實驗大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分：評分包含0～4分，得分越高則表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。1～3分納入實驗，0及4分剔除。干預(yù)完成后斷頭取腦，取手術(shù)側(cè)缺血區(qū)皮質(zhì)，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR檢測選用trizol法提取組織總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，選用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行 Real Time PCR，計算2-△△CT值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列見(表1)。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測選用含蛋白酶及磷酸酶的RIPA裂解液提取各組樣本總蛋白，應(yīng)用BCA法檢測樣本蛋白濃度，后經(jīng)電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶1000)孵育2 h后顯影發(fā)光，依據(jù)條帶灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組比較選用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分Sham組大鼠無肢體障礙出現(xiàn)；治療前MCAO組與NBP組神經(jīng)功能評分對比無差異；經(jīng)丁苯酞治療后，NBP組較MCAO組功能評分明顯降低(P<0.05)(表2)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 神經(jīng)功能評分

2.2 實時熒光定量PCR檢測EAAT1、EAAT2結(jié)果經(jīng)實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)NBP組EAAT1、EAAT2 mRNA表達(dá)較MCAO組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 各組EAAT2、EAAT1 mRNA表達(dá)變化

2.3 Western blot檢測EAAT1、EAAT2結(jié)果經(jīng)實Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NBP組EAAT1、EAAT2蛋白水平較MCAO組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表4、圖1)。

表4 各組EAAT2、EAAT1蛋白表達(dá)變化

圖1 各組細(xì)胞EAAT1、EAAT2表達(dá)情況

2.4 實時熒光定量PCR檢測AKT結(jié)果經(jīng)實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)MCAO組AKT mRNA表達(dá)為(1.041±0.306)，NBP組AKT mRNA表達(dá)明顯升高，為(1.462±0.303)，與MCAO組比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)各項生理活動，并通過“谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)”，維持其在細(xì)胞內(nèi)外的動態(tài)平衡。在缺血缺氧條件下，能量代謝嚴(yán)重異常，細(xì)胞去極化，谷氨酸轉(zhuǎn)運體功能異常，致使谷氨酸在細(xì)胞外大量堆積，過量的谷氨酸會引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高進(jìn)而過度激活N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)及AMPA受體(AMPAR)，引起谷氨酸興奮性毒性作用，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。在調(diào)節(jié)細(xì)胞外谷氨酸濃度過程中，興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體(Excitatory amino acid transporter,EAATs)發(fā)揮主要作用[12]，其中EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)是最豐富的谷氨酸轉(zhuǎn)運體[13]。有研究表明，在腦皮質(zhì)缺血發(fā)生后，EAAT1和EAAT2的表達(dá)均有升高[14]，這是機體應(yīng)對谷氨酸毒性作用的自調(diào)節(jié)機制。在臨床治療中，如果能夠擴大這種調(diào)節(jié)作用，將會減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷，起到神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用。

丁基苯酞化學(xué)名為3-丁基-1(3H)-異苯并呋喃酮[3-butyl-1 (3H) -isobenzofuranone]，又稱芹菜甲素，于芹菜葉和莖中提取，既往報道丁基苯酞在缺血性腦血管病、阿爾茨海默病及高血壓治療中均有重要作用：研究顯示，丁基苯酞能夠調(diào)節(jié)癲癇模型鼠的谷氨酸平衡，其機制與CP-AMPARs有關(guān)[15]；但其在腦缺血模型中的干預(yù)機制尚不完全清楚，本課題經(jīng)過實驗觀察，結(jié)果顯示：丁基苯酞能夠降低MCAO模型大鼠Zea Longa評分，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果相同；同時，本課題結(jié)果顯示，經(jīng)過丁基苯酞處理后，MCAO模型大鼠皮質(zhì)EAAT1和EAAT2的mRNA水平進(jìn)一步升高；應(yīng)用Western blot檢測其蛋白水平，其升高趨勢與mRNA表達(dá)相同，這一結(jié)果說明丁基苯酞能夠參與并調(diào)節(jié)MCAO模型大鼠皮質(zhì)谷氨酸循環(huán)過程，其機制與調(diào)節(jié)EAAT1和EAAT2表達(dá)有關(guān)。EAAT1和EAAT2是谷氨酸再攝取的重要轉(zhuǎn)運體，丁基苯酞促進(jìn)EAAT1和EAAT2的表達(dá)可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外谷氨酸的在攝取，降低谷氨酸-鈣超載連鎖反應(yīng)，進(jìn)而阻斷鈣超載凋亡過程，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

既往報道顯示，PI3K/AKT途徑參與減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用[16]，AKT是mTOR同路的正向調(diào)節(jié)蛋白，廣泛參與多種生理過程。為了分析丁基苯酞調(diào)解EAAT1和EAAT2表達(dá)的機制，本課題進(jìn)一步分析了丁基苯酞干預(yù)后MCAO模型大鼠皮質(zhì)AKT mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與Sham組比較，丁基苯酞處理后，MCAO模型大鼠皮質(zhì)AKT mRNA表達(dá)水平明顯升高，這一結(jié)果說明丁基苯酞能夠激活PI3K/AKT途徑使AKT表達(dá)。而這一結(jié)果可能是EAAT1和EAAT2表達(dá)升高的調(diào)解機制。

綜上所述，本課題研究發(fā)現(xiàn)丁基苯酞能夠降低MCAO模型大鼠Zea Longa神經(jīng)功能評分，促進(jìn)模型大鼠皮質(zhì)EAAT1和EAAT2的表達(dá)，同時活化PI3K/AKT途徑，提高AKT mRNA水平。說明丁基苯酞可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，具有臨床應(yīng)用價值。