楊一山，柴勝豐，唐健民，羅亞進，楊秀星，韋 霄**

(1.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西桂林 541006；3.廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)管理中心，廣西百色 533209)

鵝毛玉鳳花(Habenariadentata)系蘭科玉鳳花屬(Habenaria)的地生草本植物，主要分布于云南、安徽、福建、廣東以及廣西海拔為190-2 300 m的溝邊或山坡林地[1]，多見于土層較厚、光照較充足的山坡林地、山地道路兩側(cè)。鵝毛玉鳳花作為一種藥用植物，其藥用部位為地下塊莖，稱雙腎參、雙腎子、吊陽草(浙江)、白參草(四川)、雞卵參(廣西)，在傣藥中又稱“婉康蓋”[2]，其性平、味甘、微苦，具有散氣、解毒[3]、滋補肺腎、止咳化痰[4]、利尿、消炎等功效[5]，常用于治療病后體虛、睪丸炎、腎虛腰痛、陽痿、肺癆咳嗽、疝氣、白帶、白濁、尿路感染等疾病[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

鵝毛玉鳳花新鮮塊莖，采自廣西壯族自治區(qū)百色市樂業(yè)縣，經(jīng)廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為鵝毛玉鳳花Habenariadentata(Sw.) Schltr.塊莖。葡萄糖對照品(批號：B21882，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；95%乙醇、濃硫酸，購自西隴科學股份有限公司；5%苯酚溶液，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，以上均為分析純試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司；DL-720E型智能超聲波、AE200S型萬分之一電子分析天平，均購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自金壇雙捷實驗儀器廠；QE-100型高速粉碎機，購自浙江屹立工貿(mào)有限公司；Multifuge X1R臺式高速冷凍離心機，購自賽默飛世爾科技(中國)公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

鵝毛玉鳳花塊莖洗凈，切片，60℃烘干48 h，粉碎，過60目篩，制成樣品粉末，備用。

1.2.2 標準溶液及標準曲線的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖48 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL的容量瓶中，搖勻，得到0.48 mg/mL的標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，并分別用蒸餾水補至2 mL。然后先加入1 mL 5%的苯酚溶液，混勻后再加入4 mL的濃硫酸，搖勻，室溫下放置5 min后，于80℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，以相同方法處理下的空白試劑作為參比溶液，于490 nm處測定吸光值。以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線并計算回歸方程，回歸方程為Y=0.0444x-0.0013，R2=0.999 6。

1.2.3 供試品溶液的制備和測定

稱取0.2 g樣品粉末，按照料液比1∶59 (g/mL)，加入11.8 mL去離子水，在74℃、功率300 W的條件下提取7 h。冷卻至室溫后，離心，取上清液并采用Sevag法除蛋白，將正丁醇、氯仿(V∶V=1∶4)混合，再與提取液混合，萃取，保留水層，再加入3倍體積95%乙醇，低溫醇沉10 h。離心后，棄上清液，用熱水溶解多糖沉淀，并定容于50 mL容量瓶中，即得供試品溶液。按照標準曲線的步驟進行加樣，測定吸光度。取3組平行實驗結(jié)果計算總多糖得率，總多糖得率的計算方法如下：

(1)

式中，C為提取液中總多糖濃度(μg/mL)；V1為提取液總體積(mL)；V2為測定時所用樣品的體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量(g)。

1.3 單因素試驗

1.3.1 提取時間對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

準確稱取0.2 g樣品粉末，按照1∶60 (g/mL)料液比，加入12 mL去離子水，在80℃、功率為300 W的條件下，分別超聲提取1 h、3 h、5 h、7 h、9 h。按照1.2.3節(jié)供試品溶液的制備和測定方法進行加樣，于490 nm處測定吸光值，計算總多糖得率，每個處理做3組重復。選取最佳提取時間，然后進行下一步單因素試驗。

1.3.2 料液比對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

準確稱取0.2 g樣品粉末，分別按照料液比1∶40 (g/mL)、1∶50 (g/mL)、1∶60 (g/mL)、1∶70 (g/mL)、1∶80 (g/mL)，分別加入8 mL、10 mL、12 mL、14 mL、16 mL去離子水，在80℃、功率為300 W、提取時間為1.3.1節(jié)試驗所得的最優(yōu)時間的條件下進行超聲提取。按照1.2.3節(jié)供試品溶液的制備和測定方法進行加樣，于490 nm處測定吸光值，計算總多糖得率，每個處理做3組重復。選取最佳料液比，然后進行下一步單因素試驗。

1.3.3 提取溫度對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

準確稱取0.2 g樣品粉末，按照1.3.2節(jié)試驗所得的最優(yōu)料液比，加入相應體積的去離子水，分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，功率為300 W，提取時間為1.3.1節(jié)試驗中所得的最優(yōu)時間的條件下進行提取。按照1.2.3節(jié)供試品溶液的制備和測定方法進行加樣，于490 nm處測定吸光值，計算總多糖得率，每個處理做3組重復。

1.4 響應面分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，應用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設(shè)計。以提取時間(A)、料液比(B)和提取溫度(C)為自變量，以總多糖得率為響應值，對17個試驗點進行組合試驗。每個自變量分別有低、中、高3個水平，對這3個水平分別按照-1，0，1進行編碼，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 鵝毛玉鳳花總多糖對DPPH·清除能力的測定

參考吳冬凡等[12]的方法對DPPH·清除能力進行測定。①取10 mL的試管依次編號，加入4 mL不同濃度的樣液于試管中，加入等體積的0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分混勻，在室溫下避光保存30 min后，用無水乙醇作參比溶液，于517 nm處測定樣品液的吸光值，記為A1。②用4 mL無水乙醇代替①中DPPH溶液，測定吸光值，記為A2。③用4 mL蒸餾水代替①中樣液，與0.1 mmol/L DPPH溶液等體積混合，測定吸光值，記為A0。以相同濃度的抗壞血酸作陽性對照。

(2)

1.5.2 鵝毛玉鳳花總多糖對·OH清除能力的測定

·OH清除能力的測定參考Fenton反應體系[13]，并稍作調(diào)整。①取10 mL的試管依次編號，加入2.0 mL不同濃度的樣品溶液，然后依次加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL的蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2溶液啟動反應，在37℃恒溫水浴30 min后，用蒸餾水作參比溶液，于510 nm處測定吸光值，記為As。②用1.0 mL蒸餾水代替①中H2O2溶液，測定的吸光值記為Ab。③用2.0 mL蒸餾水代替①中樣品溶液，測定的吸光值記為Ap。以相同濃度的抗壞血酸作陽性對照。

(3)

(4)

1.5.4 鵝毛玉鳳花總多糖對總還原力的測定

總還原力測定參考朱成豪等[15]的方法。取2.0 mL不同濃度的樣品溶液，先加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液，再加入2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液，混勻，在50℃條件下水浴20 min后，迅速冷卻，最后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液來終止反應。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL的FeCl3溶液，混勻，10 min后，用蒸餾水作參比溶液，于700 nm處測定吸光值。以相同濃度的抗壞血酸做對照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，繪圖采用Origin 2019軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

由圖1可知，隨著提取時間的增加，鵝毛玉鳳花總多糖得率呈先增加后減少的趨勢，在提取時間為5 h時，總多糖得率最大，為9.09%。在達到最高點前，提取時間越長，總多糖的浸出效果越好，說明提取時間對鵝毛玉鳳花總多糖得率存在一定的影響；但在達到最高點后，總多糖的得率開始下降，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是提取時間過長，導致部分多糖的結(jié)構(gòu)被破壞。

圖1 提取時間對總多糖得率的影響

2.1.2 料液比對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，鵝毛玉鳳花總多糖得率先緩慢增加，并在料液比為1∶60 (g/mL)時達到最大值，為7.7%。隨著料液比繼續(xù)增加，總多糖得率有所下降，但幅度較小。在得率達到最高點前，總多糖的浸出效果隨著溶質(zhì)的增加而增加；在達到最高點后，總多糖已經(jīng)較為完全地浸出，即使料液比再繼續(xù)增加，總多糖的得率也無明顯變化。

圖2 料液比對總多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的增加，鵝毛玉鳳花總多糖得率明顯升高，當溫度為70℃時，得率達到最高點，為9.34%。達到最高點后，總多糖得率有下降的趨勢，可能是由于溫度過高導致總多糖水解。

圖3 提取溫度對總多糖得率的影響

2.2 響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

基于單因素試驗結(jié)果，并根據(jù)因素水平設(shè)計三因素三水平響應面分析試驗，得到17個試驗點的試驗結(jié)果，如表2所示。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

由表3的數(shù)據(jù)可知，模型的顯著性檢測P值為0.005 7 (P<0.01，極顯著)，且失擬誤差顯著性檢測P值為0.495 2 (P>0.05，不顯著)，模型的相關(guān)系數(shù)為0.912 9，矯正系數(shù)為0.800 9，綜合上述數(shù)據(jù)可知，模型的擬合效果較好，誤差小，選用的模型可以較為真實地反映出各因素與鵝毛玉鳳花總多糖得率的關(guān)系。

表3 回歸模型的方差分析

對表3的數(shù)據(jù)進行二項多元回歸擬合，得到提取時間(A)、料液比(B)和提取溫度(C) 3因素的回歸模型為Y=9.09+0.68A+7.74E-003B+0.46C-0.16AB+0.52AC-0.19BC-0.71A2-0.85B2-1.44C2，其中Y值表示鵝毛玉鳳花中總多糖的得率。一次項中，提取時間(A)對總多糖得率的線性效應為極顯著水平(P=0.009 7<0.01)，料液比(B)對總多糖得率的線性效應不顯著(P=0.969 3>0.05)，提取溫度(C)為顯著水平(P=0.049 3<0.05)；二次項中，AB、BC、AC的影響效果不顯著，A2和B2的影響效果為顯著水平(P<0.05)，C2的影響效果為極顯著水平(P=0.001<0.01)。各因素對總多糖得率的影響順序為提取溫度二次項(C2)>提取時間一次項(A)>提取溫度一次項(C)>料液比二次項(B2)>提取時間二次項(A2)>提取時間-提取溫度交互項(AC)>料液比-提取溫度交互項(BC)>提取時間-料液比交互項(AB)>料液比一次項(B)。由F值可知，單因素對總多糖得率的影響大小依次為提取時間(A)>提取溫度(C)>料液比(B)。

2.2.2 響應面交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6軟件和回歸模型，繪出相應的等高線和響應面三維曲線圖。等高線越密集，表明該因素對總多糖得率的影響效果越顯著。兩個因素交互作用的強弱還可以通過等高線的形狀來判斷，等高線若呈橢圓形則說明兩因素的交互作用顯著。此外，三維立體圖的曲面傾斜程度也可以判斷各因素之間的交互作用。由圖4可知，提取時間(A)的等高線相比于料液比(B)較為密集[圖4(a)]，說明提取時間(A)對總多糖得率的影響較料液比(B)的影響顯著。等高線為圓形且三維曲線圖傾斜度較小，說明提取時間(A)和料液比(B)的交互作用不顯著[圖4(b)]；同理，提取時間(A)對總多糖得率的影響較提取溫度(C)的影響顯著[圖4(c)]。提取時間(A)和提取溫度(C)的交互作用比提取時間(A)和料液比(B)的交互作用顯著[圖4(d)]；提取溫度(C)對總多糖得率的影響較料液比(B)的影響顯著[圖4(e)]，且提取溫度(C)和料液比(B)的交互作用不如提取時間(A)和提取溫度(C)的交互作用顯著[圖4(f)]。綜上可知，各因素交互作用的大小順序為提取時間-提取溫度(AC)>料液比-提取溫度(BC)>提取時間-料液比(AB)。

圖4 交互因素對鵝毛玉鳳花總多糖得率影響的響應曲面圖

2.2.3 優(yōu)化與驗證試驗

對響應面得出的數(shù)據(jù)進行綜合分析，得出鵝毛玉鳳花總多糖的最佳提取條件為提取時間7 h，料液比為1∶58.7 (g/mL)，提取溫度為73.49℃，在此條件下，鵝毛玉鳳花總多糖的理論得率為9.61%。為方便試驗，將最佳提取條件設(shè)置為提取時間7 h，料液比為1∶59 (g/mL)，提取溫度為74℃，在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到總多糖的實際得率為9.59%，相對標準偏差(RSD)為0.13%，與模型預測值相差0.02%，表示該模型可以較好地對總多糖的提取工藝進行優(yōu)化，且重現(xiàn)性較好。

2.3 鵝毛玉鳳花總多糖的體外抗氧化活性

圖5 鵝毛玉鳳花總多糖對的清除能力及總還原力

3 討論

鵝毛玉鳳花作為一種天然藥物，其發(fā)揮藥效功能的物質(zhì)基礎(chǔ)并不是單一的，而是由各種成分綜合作用的結(jié)果，但本研究僅對鵝毛玉鳳花中總多糖含量和抗氧化能力進行測定，還未對多糖類成分或其他類型的活性物質(zhì)進行深入研究，未來仍需進一步探究其抗氧化能力，以確定發(fā)揮此類功效的主要活性物質(zhì)，為其后續(xù)的研究和實際應用提供理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應面試驗，對鵝毛玉鳳花總多糖的提取工藝進行優(yōu)化，得出3個因素對鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響大小依次為提取時間(A)>提取溫度(C)>料液比(B)。鵝毛玉鳳花總多糖的最佳提取工藝參數(shù)為提取時間7 h，料液比1∶58.7 (g/mL)，提取溫度73.49℃，優(yōu)化驗證后的總多糖得率為9.59%?？寡趸芯拷Y(jié)果顯示，鵝毛玉鳳花總多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50值分別為1.385 mg/mL、0.006 mg/mL、0.020 mg/mL，總還原能力是L-抗壞血酸的2.24%。綜上可知，鵝毛玉鳳花總多糖有較好的抗氧化活性，具有廣闊的發(fā)展利用空間。