張麗，周忠，陳默，陳秋悅，萬雅璐，王倩

（貴州省貴陽市公共衛(wèi)生救治中心 呼吸與危重癥學(xué)科，貴州 貴陽 550002）

0 引言

結(jié)核性腦膜炎是結(jié)核分枝桿菌感染所引發(fā)的脊膜、腦膜的非化膿性炎癥性疾病，是肺外結(jié)核的一種，多數(shù)患者均有急性、亞急性、慢性血行播散型肺結(jié)核，其殘疾率與死亡率均較高[1-2]。結(jié)核性腦膜炎，其起病隱匿，具有進(jìn)展速度慢特點(diǎn)，部分患者的疾病起病急驟，在疾病的早期，疾病癥狀較為輕微，但是患者顱內(nèi)壓水平的升高，可出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高、腦膜刺激征等的表現(xiàn)[3]，如視乳頭水腫、嘔吐、頭痛等，病情嚴(yán)重者會出現(xiàn)去皮質(zhì)狀態(tài)、腦強(qiáng)直發(fā)作等的情況[4]，對患者的生命安全，造成威脅，因此，積極做好患者疾病的診斷以及治療干預(yù)，對其預(yù)后改善意義重大。本研究主要對不同的檢測技術(shù)，在診斷結(jié)核性腦膜炎中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取結(jié)核性腦膜炎患者，為其實(shí)施細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)（腦脊液抗酸桿菌涂片、腦脊液分枝桿菌慢速培養(yǎng)）、分子生物學(xué)檢測方法[腦脊液結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測（即PCR檢測法），腦脊液結(jié)核分枝桿菌的檢測，利福平耐藥基因檢測（Gene Xpert檢測）]、免疫學(xué)檢測方法[PPD試驗(yàn)（結(jié)核菌素試驗(yàn)）、外周血T-SPOT·TB（外周血T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)）]、腦脊液常規(guī)、生化實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果等檢測，例數(shù)276例，時(shí)間為2020年1月-2021年12月，對其檢測的結(jié)果進(jìn)行分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診存在結(jié)核性腦膜炎；局部神經(jīng)損害癥狀者。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他感染所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；伴有腰穿禁忌證者；近期（3個(gè)月）抗結(jié)核治療者。276例患者中，年齡16～66歲，平均（40.36±11.27）歲；病程1～39d，平均（16.98±7.22）d。

1.2 方法

1.2.1 PPD檢測

左前臂掌側(cè)1/3處，將0.1mL卡介菌純白蛋白衍生物稀釋劑注入，48～72h后，檢查注射部位，測量浸潤硬結(jié)的相關(guān)垂直徑，并測量橫徑，若均值≥5mm，即代表為陽性，若在<5mm，則為陰性。

1.2.2 T-SPOT·TB檢測

肝素抗凝管，外周靜脈血采集，5～10mL，密度梯度離心法作外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離，已包被抗體微量板四孔中，將濾液培養(yǎng)蛋白10、早期分泌性靶抗原6、陽性對照植物血凝素、陰性對照細(xì)菌培養(yǎng)液等加入，每孔中，將外周血單個(gè)核細(xì)胞加入后，于37℃的培養(yǎng)中，進(jìn)行培育，培訓(xùn)時(shí)間為16～20h。采用磷酸鹽緩沖液，實(shí)施5次的洗滌免疫，200倍稀釋濃度標(biāo)記抗體試劑，在每個(gè)反應(yīng)孔中，均加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相關(guān)鏈霉菌卵白素，在37℃的溫度下，進(jìn)行1h孵育，磷酸鹽緩沖液5次洗滌，每個(gè)反應(yīng)孔中加入50ulACE底物顯色溶液，室溫中孵育7min。去離子水洗滌培養(yǎng)板，終止反應(yīng)。室溫干燥培養(yǎng)板每個(gè)反應(yīng)孔中，深藍(lán)色清晰斑點(diǎn)的數(shù)目，進(jìn)行記錄。陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≤5個(gè)，檢測孔A、B斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，為陽性；陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，檢測孔A、B斑點(diǎn)數(shù)≥陰性對照孔2倍斑點(diǎn)數(shù)，為陽性；反之為陰性。

1.2.3 培養(yǎng)慢速培養(yǎng)腦脊液分枝桿菌

腰穿后取1～2mL腦脊液實(shí)施結(jié)核菌的培養(yǎng)，以全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)鑒定/藥敏儀實(shí)施結(jié)核菌的培養(yǎng)，并實(shí)施藥敏試驗(yàn)，按照操作說明，對腦脊液培養(yǎng)，8周后若無菌生長，則表示為陰性。

1.2.4 腦脊液結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測

多采用檢測試劑盒，即樣品DNA提取試劑，PCR反應(yīng)試劑、特異性擴(kuò)增引物，所述特異性擴(kuò)增引物有16SrRNA擴(kuò)增引物MTC與Rv0355擴(kuò)增引物CD192組成，分析結(jié)核與肺結(jié)核分枝桿菌種屬特異性基因，優(yōu)化引物選擇設(shè)計(jì)，并優(yōu)化檢測條件，提供更準(zhǔn)確、更加靈敏、更加快捷的結(jié)果?？赏ㄟ^擴(kuò)增產(chǎn)物是否生成來判斷目標(biāo)基因是否存在。

1.2.5 Gene Xpert檢測（腦脊液結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測）

以IS6110和gyrB為靶基因，針對靶基因的六個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)F3，B3，F(xiàn)IP，BIP四條特異性引物。終產(chǎn)物為具有不同莖長度莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA和帶有許多環(huán)折疊結(jié)構(gòu)的DNA混合物，可通過擴(kuò)增產(chǎn)物是否生成來判斷目標(biāo)基因是否存在。

1.3 觀察指標(biāo)

對結(jié)核性腦膜炎患者經(jīng)PPD檢測、腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、外周血T-SPOT·TB檢測、腦脊液結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測、腦脊液結(jié)核分枝桿菌檢測及利福平耐藥基因檢測等多種方法疾病檢出情況分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS 22.0軟件實(shí)施數(shù)據(jù)處理，方差同質(zhì)性檢驗(yàn)方法，定性數(shù)據(jù)以“χ2”核實(shí)，采用（%）表達(dá)。P<0.05，顯著差異。

2 結(jié)果

多種方法聯(lián)合檢測，相較于單一方法檢測，其對結(jié)核性腦膜炎的檢出率，更高（P<0.05），如表1。

表1 不同方法對結(jié)核性腦膜炎疾病檢出情況分析[n(%)]

3 討論

結(jié)核性腦膜炎是結(jié)核分枝桿菌，侵入至其蛛網(wǎng)膜下腔，所致蛛網(wǎng)膜、軟腦膜累及腦血管部分、腦實(shí)質(zhì)病變的疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)核疾病。結(jié)核性腦膜炎發(fā)生后，有著較高的殘疾率以及死亡率，因此，及時(shí)為結(jié)核性腦膜炎患者實(shí)施診斷，并采取治療干預(yù)，對患者病情的改善有重大意義。結(jié)核性腦膜炎的癥狀與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染較相似，誤診率較高，臨床常選擇腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)、腦脊液涂片鏡檢等方法，實(shí)施疾病的診斷，雖然有著一定的價(jià)值，但是陽性檢出率較低，且易發(fā)生假陽性[5-7]，因此，應(yīng)選擇更加合理的方法，進(jìn)行疾病的檢測。

本研究中，多種方法聯(lián)合檢測，相較于單一方法檢測，其對結(jié)核性腦膜炎的檢出率更高，P<0.05。即代表多種方法聯(lián)合檢測，于結(jié)核性腦膜炎診斷中，有著較高的價(jià)值。PPD在結(jié)核性腦膜炎診斷中應(yīng)用，雖然可獲得一定的效果，但是其單獨(dú)應(yīng)用，較易出現(xiàn)假陽性的情況。結(jié)核病原學(xué)是對結(jié)核性腦膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是較易受到標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量的相關(guān)影響，且培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的周期較長，其檢測的陽性率較低，對于疾病早期快速診斷，存在一定的局限性。隨著PCR技術(shù)水平的不斷進(jìn)步，使得腦脊液結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測的應(yīng)用價(jià)值得以提高，靈敏度較高，研究顯示，檢測腦脊液結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸，診斷結(jié)核性腦膜炎，其敏感度的差異性可能與實(shí)驗(yàn)室PCR所用的引物、靶基因、反應(yīng)條件不同等有關(guān)，但是其特異度較高，相較于結(jié)核病原學(xué)，其有著較高的靈敏度以及特異度，因此，腦脊液結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷中有著一定的價(jià)值[8-9]。利福平耐藥基因檢測是美國公司研發(fā)的半巢式的一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外診斷方法，其是以利福平耐藥基因rpoB基因作為靶向基因，在2h內(nèi)同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌以及對利福平是否耐藥的檢測，此種方法被WHO推薦用于診斷肺外結(jié)核中。利福平耐藥基因檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷中應(yīng)用，有著較高的時(shí)效性，且能夠?qū)颊叩牟∏?、預(yù)后以及生存情況進(jìn)行一定的判斷，對患者疾病的診治有著一定的指導(dǎo)意義[10-11]。ESAT-6/CFP-10融合蛋白，是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因RD-1區(qū)域，結(jié)核特異性蛋白抗原，經(jīng)在少數(shù)致病性的分枝桿菌的基因組中存在，也可在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中存在，可刺激細(xì)胞，使其產(chǎn)生INF-γ，在結(jié)核性疾病診斷中，受到卡介苗等因素的影響較小，因此兩種抗原多肽結(jié)合制備，可提高檢測的特異性，且能夠提高檢測的敏感性[12-13]，此種方法多數(shù)應(yīng)用于2周以上原因不明發(fā)熱者結(jié)核病篩查中，或者存在HIV感染、免疫力低下等肺外結(jié)核病等患者的相關(guān)診斷中疾病診斷中，卡介苗接種人群對于結(jié)核病的篩查，此技術(shù)操作簡單，且具有快捷的優(yōu)點(diǎn)，能夠避免患者出現(xiàn)免疫功能損傷，所致假陽性的情況。根據(jù)以上原理，外周血T-SPOT·TB檢測可對結(jié)核抗原特異性T淋巴細(xì)胞檢測，可采取酶聯(lián)免疫吸附法及酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法，在特異性抗原刺激下，生成特異性INF-γ[14]。外周血T-SPOT·TB檢測具有簡單快捷的特點(diǎn)，可防止免疫功能受損所致假陽性的情況，更好提高疾病的檢出率[15]。雖然外周血T-SPOT·TB檢測有著一定的應(yīng)用價(jià)值，但是單一方法進(jìn)行疾病的診斷，易出現(xiàn)誤診與漏診的情況，臨床常將多種檢測方法相結(jié)合，以此促進(jìn)疾病檢出率的提高。

綜上所述，不同方法在結(jié)核性腦膜炎患者疾病診斷中應(yīng)用，均有著一定的價(jià)值，多種方法聯(lián)合檢測，可更好為患者疾病的診治提供參考依據(jù)，意義重大。