劉 馨 文 明 袁 陽

貴州大學動物科學學院，貴陽 550025

禽流感病毒是威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一類重要病原，可造成家禽養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟損失。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球感染H5N1 型禽流感超1 000 例，感染H7N9 近3 000 例，死亡率高達40%[1]。因此，加強禽流感病毒的監(jiān)測和防治對保障家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展及公共衛(wèi)生安全具有重要意義。目前，用于禽流感血清學檢測的方法包括血凝和血凝抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、瓊脂擴散試驗以及中和試驗等，其中血凝和血凝抑制試驗利用標準陰陽性血清進行檢測，具有特異性強、準確度高的特點，被廣泛用于禽流感病毒的臨床檢測。畢節(jié)市作為貴州省西北部的一個生態(tài)養(yǎng)殖類大市，家禽養(yǎng)殖業(yè)正處于蓬勃發(fā)展階段[2]。本研究通過對畢節(jié)市中小型養(yǎng)禽場血清的抗體水平以及同一養(yǎng)禽場不同時間段進行檢測，充分掌握畢節(jié)市中小型養(yǎng)禽場禽流感免疫數(shù)據(jù)，以期為后期指定免疫程序提供參考，有效提升養(yǎng)禽場的免疫程序合理性，為禽流感的預防和監(jiān)測提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

16 家中小型養(yǎng)禽場血清樣本由畢節(jié)市七星關區(qū)動物疫病預防控制中心提供，其中，采集中型養(yǎng)殖場血清樣本均為10 份，小型養(yǎng)殖場血清樣本4～9份不等，共計140 份；2020年8月、2020年12月和2021年4月3 個季度月由畢節(jié)市A 場提供，不同時間段血清樣本數(shù)量分別為17、50 和60 份，共計127份。

1.2 方 法

1）樣品采集。翅靜脈采取2 mL/只雞全血，等量裝入離心管中2 000 r/min 離心5 min。待離心結束后，用滴管吸取上清液，按序標號（注意避免溫度過低造成樣品呈果凍樣從而無法析出血清），置于-20 ℃冰箱內待檢。

2）HA-HI 試驗。HA 試驗中取一次性96 孔V 型微量反應板，于1～12 孔中依次分別加入0.025 mL PBS溶液；吸取0.025 mL 標準病毒原液加入第1 孔中，反復吹打數(shù)次混勻；從第1 孔吸取0.025 mL 病毒液加入第2 孔，吸取0.025 mL 加入第3 孔，重復上述操作，依此倍比稀釋至第11 孔，混勻后吸取0.025 mL 棄之。第12 孔留做空白對照；吸取0.025 mL PBS 依次加入；充分混勻紅細胞懸液，依次加入0.025 mL 體積分數(shù)1%的雞紅細胞懸液；振蕩混勻，于2～8 ℃下靜置45～60 min 觀察結果。而HI 試驗則利用相同原理倍比稀釋后吸取0.025 mL 4HAU 抗原依次于1～11 孔加入，于20～25 ℃室溫下靜置30 min；每孔依次加入0.025 mL 體積分數(shù)為1%的雞紅細胞溶液，震蕩均勻后靜置30 min 觀察結果，紅細胞將呈明顯紐扣狀沉淀。

2 結果與分析

2.1 16 家中小型養(yǎng)禽場血清抗體水平

經(jīng)調查顯示（表1）：140 份受檢血清樣本中，H5亞型禽流感血清抗體陽性為110 份，H7 亞型禽流感血清抗體陽性為104 份；H5 亞型平均陽性率為77.74%，H7 亞型平均陽性率為73.66%。以群體免疫陽性率達75%及以上者定義為合格，16 個中小型養(yǎng)禽場中，H5 亞型血清抗體5 個不合格，H7 亞型血清抗體6 個不合格，平均合格率分別為68.75%和62.5%。

表1 畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場血清抗體水平

16 家中小型養(yǎng)禽場H5 亞型禽流感血清抗體水平陽性率最高為100%，最低為0%，其中8 家養(yǎng)禽場抗體水平達100%，2 家抗體水平為0%（圖1）。H7 亞型禽流感血清抗體水平最高陽性率為100%，最低為0%，其中有8 家養(yǎng)禽場抗體水平達100%，有2 家抗體水平為0%（圖2）。

圖1 16 家養(yǎng)禽場H5 亞型血清抗體陽性率

圖2 16 家養(yǎng)禽場H7 亞型血清抗體陽性率

140 份受檢血清樣本中，H7 亞型抗體效價為8的血清樣本共44 份，而抗體效價為1、9 和10 的血清樣本為0 份（表3）。

2.2 A 場不同時間點血清抗體水平

對2020年8月、2020年12月以及2021年4月的3 個時間點共檢測血清樣本127 份。其中H5陽性數(shù)為120 份，平均陽性率為94.13%；H7 陽性數(shù)為127 份，平均陽性率為100%。以群體免疫達75%以上定義為合格，結果發(fā)現(xiàn)2 種高致病性血清亞型均為合格。其中，A 場H5 亞型血清抗體水平在2020年8月、12月2021年4月分別為94.1%、90.0%和98.3%，H7 亞型血清抗體呈穩(wěn)定狀態(tài)，在2020年8月、12月和2021年4月均為100%（表2）。

表2 A 場不同時間點血清抗體水平

3 討 論

對畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場高致病性禽流感調查發(fā)現(xiàn)，H5 亞型血清抗體的平均陽性率為77.74%，H7 亞型血清抗體的平均陽性率為73.66%。以群體免疫比例為75%及其以上定義為符合標準，則H5 亞型血清抗體水平合格率為68.75%，H7 亞型血清抗體合格率為62.5%；畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場H5 血清抗體分布中，HI 效價為8 的比例最高，為44%，HI 效價為5 最低，為3%。未發(fā)現(xiàn)HI 效價為1、9 和10 的存在；畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場H7 血清抗體分布中，HI 效價為8 的比例最高，為31%，而HI 效價為0 僅次于8，占比為21%，HI 效價為2 最低，為2%。未發(fā)現(xiàn)HI 效價為1、9 和10 的存在；對A 場不同季節(jié)的血清學試驗研究發(fā)現(xiàn)，血清抗體水平隨檢測時間的變化而變化：冬季時期（12月）H5 亞型血清抗體水平最低，而春秋季時期（8月、4月）血清抗體水平較高。