錢小娟，蔣森，蔡倩，劉娜，張楊，楊新玲

帕金森病(PD)是一種常見的與年齡相關的神經退行性疾病，是目前嚴重危害國民健康和生活質量的疾病之一[1]。PD主要的病理學特征為黑質中路易小體(LBs)的積累和攜帶LBs的多巴胺能神經元的凋亡，LBs是存活于神經元中的嗜酸性包涵體，富含多種蛋白，包括α-突觸核蛋白(α-syn)、Parkin蛋白、泛素等，其中α-syn是其最重要的成分。盡管許多遺傳和環(huán)境因素與PD的發(fā)展有關，但疾病的確切病因目前尚不清楚。越來越多的證據表明，神經免疫炎癥及α-syn聚集體在神經元間傳遞可能共同參與了PD的進展[2]。淋巴細胞活化基因-3(LAG-3)是一種α-syn特異性膜蛋白受體，可與細胞外病理性α-syn結合，參與α-syn的內吞和促進α-syn傳遞，且加速了病理性α-syn誘導的多巴胺能神經元損傷和神經毒性的形成?？扇苄訪AG-3(sLAG-3)是成熟LAG-3裂解的產物，被認為是輔助T細胞活性的重要指標，一定程度可反映CNS的炎癥活動，在CSF和外周血中能穩(wěn)定表達[2-3]。更多的研究專注于探索新的生物學標志物，如α-syn、多巴胺代謝物、促炎因子、miR-221等，然而臨床上仍缺乏診斷價值較高且能有效地用于PD診斷和預測疾病進展的生物學標記物[4]。

本研究探討了PD組與對照組中血清sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn表達水平的差異，分析了血清sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn與PD臨床癥狀及疾病嚴重程度的相關性，研究了血清sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn對PD患者的診斷效能和血清sLAG-3與血漿和紅細胞α-syn的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2020年12月至2021年4月于新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經內科住院的47例PD患者作為PD組。納入標準：(1)由神經內科醫(yī)師診斷、符合英國PD腦庫的原發(fā)性PD診斷標準；(2)患者能夠提供詳細真實的臨床資料并完成相關量表的測評。排除標準：(1)帕金森綜合征；(2)嚴重認知功能障礙不能配合檢查患者及合并腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及急慢性感染的患者。選取本院門診同期年齡、性別與PD患者相匹配的36名健康體檢者作為對照組。納入標準：(1)無PD和PD家族史。(2)無其他神經系統(tǒng)退行性疾病史。排除標準：不能配合檢查患者及合并腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及急慢性感染患者。本研究所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 所有受試者均由專業(yè)神經內科醫(yī)師采集其病史和人口學資料，包括年齡、性別、吸煙飲酒史、慢性病史、Hoehn-Yahr(H-Y)分級、統(tǒng)一PD評分量表(UPDRS)、PD非運動癥狀評價量表 (NMSS)及病程等。

1.2.2 sLAG3水平檢測 清晨抽取所有受試者空腹肘靜脈血4 ml，采用離心機以5 000 r/min的轉速離心10 min，移取上清液至EP管，放-80 ℃冰箱保存。相關檢測均嚴格遵循對應試劑盒的操作指南進行，每個樣本做兩個復孔,最終數據取均值。

1.2.3 血漿和紅細胞α-syn水平檢測 用含有抗凝劑的抽取所有受試者空腹肘靜脈血4 ml，采用離心機以5 000 r/min的轉速離心10 min，分離血漿和紅細胞，分別置于EP管，放-80 ℃冰箱保存。采用ELISA檢測血漿和紅細胞α-syn水平。相關檢測均嚴格遵循對應試劑盒的操作指南進行，每個樣本做兩個復孔,最終數據取均值。

2 結 果

2.1 兩組一般臨床資料及檢測指標比較 見表1。

表1 一般臨床資料的比較[x±s,例(%),M(Q25,Q75)]資料PD組(n=47)對照組(n=36)t/Z/χ2值P值年齡(歲)64.98±10.9762.25±9.461.1910.237男性20(42.6)19(52.8)0.8560.355糖尿病5(10.6)6(16.7)0.6440.442高血壓14(29.8)11(30.6)0.0060.940吸煙9(19.1)6(16.7)0.8500.771飲酒5(10.6)7(19.4)1.2780.258sLAG3(ng/mL)0.94(0.78,1.04)0.72(0.55,0.85)-5.023<0.001 紅細胞α-syn(ng/mL)61.15(59.67,61.06)48.61(42.06,55.34)-6.584<0.001血漿α-syn(ng/mL)30.20(26.92,33.41)22.66(19.70,26.57)-6.469<0.001

兩組年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒史比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與對照組比較，PD組血清sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.2 sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平與PD臨床特征的相關性分析 見表2。在PD組中，行Spearman相關分析顯示，血清sLAG-3水平與性別(R=0.421,P=0.003)和NMSS(R=0.323,P=0.027)相關，而與病程、H-Y分級、UPDRS Ⅲ、NMSS總分不相關(均P>0.05)。紅細胞α-syn和血漿α-syn水平與性別、病程、H-Y分期、UPDRS Ⅲ、NMSS總分均不相關(均P>0.05)。

表2 sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平與PD臨床特征的相關性分析血清sLAG-3RP值血漿α-synRP值紅細胞α-synRP值性別0.4210.003-0.0270.8570.0100.949病程-0.0020.988-0.2260.127-0.0200.895H-Y分期-0.0160.915-0.0320.829-0.0710.636UPDRSⅢ0.0270.858-0.1360.362-0.1950.189NMSS0.3230.027-0.2670.0700.0350.814

2.3 ROC曲線分析血清sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平對PD發(fā)病的診斷價值 見圖1、表3。將血清sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平作為檢驗變量，將PD和對照分組作為狀態(tài)變量制作ROC曲線，血清sLAG-3水平診斷PD的曲線下面積為0.822(95%CI：0.735～0.909)，敏感度61.7%、特異度86.1%。紅細胞α-syn水平診斷PD的曲線下面積為0.923(95%CI：0.871～0.976)，敏感度83.0%、特異度83.3%。血漿α-syn水平診斷PD的曲線下面積為0.916(95%CI：0.860～0.972)，敏感度為97.7%、特異度為66.7%。

圖1 sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平對PD診斷價值的ROC曲線

表3 ROC曲線分析血清sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平對PD發(fā)病的診斷價值變量ROC曲線下面積約登指數敏感度特異度sLAG-30.822(0.735～0.909)0.48361.7%86.1%紅細胞α-syn0.923(0.871～0.976)0.66383.0%83.3%血漿α-syn0.916(0.860～0.972)0.66797.7%66.7%

2.4 不同濃度sLAG-3分組中sLAG3、紅細胞α-syn、血漿α-syn表達水平的比較 見表4。根據sLAG-3水平ROC曲線取sLAG3最佳截斷值0.885 ng/ml，將所有受試者重新分組：高sLAG-3組和低sLAG-3組，比較兩組sLAG3、紅細胞α-syn、血漿α-syn表達水平的差異。高sLAG-3組中sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn表達水平均明顯高于低sLAG-3組水平，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表4 高sLAG-3組和低sLAG-3組sLAG-3、紅細胞α-syn、血漿α-syn水平的比較[M(Q25,Q75),x±s]組別LAG-3紅細胞α-syn血漿α-syn低sLAG-3組(n=49)0.71(0.59,0.80)53.40±10.2726.17±5.37高sLAG-3組(n=34)0.98(0.94,1.08)60.74±8.7528.58±4.40t/Z值7.716-3.397-2.161P值<0.0010.0010.034

2.5 血清sLAG-3與紅細胞α-syn和血漿α-syn水平的二元Logistic回歸分析 見表5。將所有受試對象的血漿α-syn、紅細胞α-syn水平作為協(xié)變量，不同LAG-3濃度分組作為因變量，二元回歸分析顯示紅細胞α-syn水平與sLAG-3相關(P<0.05，OR=1.073)。

表5 血清sLAG-3與紅細胞α-syn和血漿α-syn水平的二元Logistic回歸分析變量BSEWalsP值OR值95%CI下限上限血漿α-syn0.0410.0520.6310.4271.0420.9411.155紅細胞α-syn0.0710.0286.2190.0131.0731.0151.134

3 討 論

病理性α-syn的擴散是PD進展的關鍵過程，目前研究[5]發(fā)現，α-syn在細胞間的傳遞有以下幾個途徑，如LAG-3、外泌體、小膠質細胞、腸神經、納米隧道管、經典的內吞和胞吐途徑等。LAG-3作為細胞表面的受體，優(yōu)先結合淀粉樣蛋白中的α-syn，從而啟動α-syn在細胞間的傳遞[6]。Zhang等[7]揭示了LAG-3 D1結構域通常以有堿性的表面來結合α-syn的酸性碳末端，特別是其殘基118至140。病理性α-syn的形成不僅破壞α-syn的C端與形成淀粉樣蛋白的核心分子相互作用，還可以將C端凝聚在原纖維表面上，顯著提高α-syn與受體的結合親和力，加速α-syn在細胞間的傳遞。已有動物模型[8]證實了LAG-3參與病理性α-syn跨細胞轉移，并促進PD的發(fā)生發(fā)展。LAG-3成熟后裂解形成的sLAG-3可通過血-腦屏障到達外周血中，并在血液中穩(wěn)定表達。

Guo等[9]采用MSD電化學發(fā)光(ECL)技術測定CSF和血清中的sLAG-3，結果顯示，與對照組相比，PD患者CSF中的sLAG-3水平較低(P<0.001)，而兩組間血清sLAG-3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=0.16)。本研究及其他研究[10-12]結果提示PD患者的血清sLAG-3水平相對于對照組升高，上述結果不一致，差異部分可能為研究采用了不同的檢測技術，相比ELISA檢測技術，ECL技術具有更高的重復性、穩(wěn)定性、靈敏度和同質性[13]。

Guo等[9]進一步對3個LAG-3單核酸基因多態(tài)性進行了基因分型，其中rs1922452-AA和rs951818-CC基因型被證實會增加中國女性PD的發(fā)病風險。目前sLAG-3性別表達差異的原因有可能與基因變異、炎癥反應及雌激素水平等有關。雌激素會影響神經免疫功能并上調MHC Ⅰ和Ⅱ的表達，LAG-3作為免疫調節(jié)劑與MHC-Ⅱ分子有很高的親和力，雌激素可通過MHC-Ⅱ受體抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，調節(jié)CNS的神經炎癥過程，對神經細胞有保護作用[14]。本研究中，女性sLAG-3水平0.90(0.69,1.02)高于男性sLAG-3水平0.79(0.70,0.89)，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.119)。該結果與已報道的結果不一致，主要是本研究納入的女性PD患者并非全是絕經后女性，卵巢功能尚存，體內的雌激素對炎癥反應抑制較弱，神經細胞仍受雌激素保護；樣本量較少，有實驗誤差，進一步做單因素相關分析時發(fā)現，sLAG-3表達水平與性別相關(R=0.421,P=0.003)。目前對sLAG-3水平與疾病的嚴重程度、認知、NMSS及病程的相關性研究結果不一致。郭丹丹[12]研究結果顯示，sLAG-3水平與H-Y有關，與UPDRS各部分評分、病程、NMSS不相關。Cui等[11]的一項多中心研究發(fā)現，sLAG-3水平與疾病運動癥狀的嚴重程度不相關，與NMSS量表有相關性，尤其與非運動癥狀中的日間過度嗜睡有關。在本研究發(fā)現，sLAG-3水平與H-Y分期、UPDRSⅢ、病程均不相關(P>0.05)，與NMSS量表相關(R=0.323,P=0.027)。綜上所述，sLAG-3水平與PD病情嚴重程度的關系尚不明確，本研究納入的PD患者多為服藥后的患者，抗PD藥物可能會削弱了sLAG-3與運動癥狀嚴重程度的相關性，因此，未來需要納入更多初發(fā)病的PD患者做進一步研究。以往對非運動癥狀的研究[11,15]顯示，炎癥因素的增加與認知功能下降、睡眠行為障礙、疲勞和抑郁等有關，由于sLAG-3是與細胞因子分泌相關的細胞免疫指標，一定程度上可以反映PD非運動癥狀的嚴重程度。

α-syn主要是細胞內聚集蛋白。既往研究[16]發(fā)現，PD患者CSF中有α-syn寡聚體。α-syn寡聚體可透過血-腦屏障進入外周血中，而血液中幾乎所有(99%)的α-syn都包含在紅細胞中，血漿僅含0.1%、外周血單核細胞包含0.05%、血小板包含0.2%。血漿α-syn研究結果非常不一致，可能與不同程度的溶血有關[17]。由于紅細胞是在制備過程中有分離和洗滌，因此溶血過程中被破壞的細胞膜或細胞內含物的污染不太可能會影響到紅細胞α-syn水平。Foulds等[18]對血漿中α-syn表達水平研究發(fā)現，與對照組相比磷酸化α-syn表達水平明顯高于對照組，而總的α-syn和寡聚體α-syn水平兩組間差異無統(tǒng)計學意義。Tian等[16]對紅細胞中的總α-syn、寡聚體α-syn和磷酸化α-syn(pS129)研究發(fā)現，與對照組相比PD組總α-syn和磷酸化α-syn明顯高于對照組，而兩組間寡聚體α-syn差異無統(tǒng)計學意義。本研究發(fā)現，PD患者血漿及紅細胞中的α-syn明顯高于對照組，兩組紅細胞中的α-syn水平明顯高于血漿的α-syn水平，這與一些研究[4,19]結果一致。

目前對紅細胞和血漿中α-syn與PD病程、臨床癥狀嚴重程度研究結果尚不一致。Wang等[4]研究結果顯示，紅細胞α-syn水平與臨床特征無明顯的相關性，而血漿α-syn與病程、MoCA評分、H-Y分期、UPDRS存在明顯的正相關。Chahine等[20]發(fā)現血漿α-syn與疾病的嚴重程度相關。本研究發(fā)現紅細胞和血漿α-syn水平與病程、H-Y分期、UPDRS、NMSS均不相關，這與研究[17,19]得出的結果一致?？赡艿脑驗棣?syn寡聚體對PD的更多作用于多巴胺神經元凋亡的促發(fā)階段，包括改變細胞骨架、增加膜通透性、促進Ca2+內流等，而非多巴胺神經凋亡的結果，因此推測，PD患者外周血α-syn水平檢測疾病進展的價值較低。

本研究比較了sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn表達水平對PD的診斷效能，ROC曲線顯示，檢測血清sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn表達水平對診斷PD都有一定的診斷價值。根據sLAG-3最佳截斷值將所有受試者分組后顯示，高sLAG-3組中的紅細胞和血漿α-syn水平均高于低sLAG-3組。進一步對紅細胞和血漿α-syn水平做回歸分析發(fā)現，紅細胞α-syn與sLAG-3相關。α-syn寡聚體透過血-腦屏障進入外周血，大部分聚集于紅細胞內，而LAG-3作為細胞表面受體可特異性地結合α-syn寡聚體。由此推測，LAG-3可能參與了α-syn寡聚體聚集于紅細胞的過程，有促使紅細胞內α-syn寡聚體形成的作用。

綜上所述，血清 sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn在PD組中有高表達；PD組中血清sLAG-3水平與性別、NMSS相關；血清sLAG-3與紅細胞α-syn水平有相關性，檢測血清sLAG-3、紅細胞α-syn和血漿α-syn水平對PD都有一定的診斷價值。