廖旺 楊少青 劉重旭 羅皓雨 侯濤 路關(guān)超

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州 510260；2陜西省富平縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，渭南 711700

卒中是老年人致死、致殘的最主要原因之一［1］。缺血性中風(fēng)更為常見，占所有中風(fēng)的87%［2］。缺血性中風(fēng)通常是由血塊阻塞腦部動脈引起的。組織血纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA）是一種可分解血栓的溶栓藥，是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的唯一治療缺血性中風(fēng)的藥物［3］。但是，中風(fēng)患者必須在中風(fēng)癥狀發(fā)作后4.5 h 內(nèi)接受此治療。在此治療時間范圍之外使用tPA 進行治療可導(dǎo)致出血性轉(zhuǎn)化，可能對腦造成額外損害［4］。如果患者未在時間窗內(nèi)到醫(yī)院就診，血凝塊無法清除則可能導(dǎo)致殘疾等卒中后遺癥［5］。目前認為，腦缺血后細胞死亡的病理生理機制是由于血流中斷，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，從而觸發(fā)細胞凋亡、炎癥、興奮性中毒、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙過程，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，其中谷氨酸興奮性毒性是其重要特征。當(dāng)神經(jīng)細胞損傷，谷氨酸被大量釋放到神經(jīng)突觸間隙，從而導(dǎo)致谷氨酸受體過度激活，進而使鈣離子不斷向神經(jīng)元內(nèi)流，最終引起DNA 損傷以及細胞凋亡等病理過程［6］。近期研究表明，腦缺血發(fā)生后，微小RNA（miR）表達譜可發(fā)生不同程度改變，這些miR 與炎癥、自噬、凋亡和氧化應(yīng)激均密切相關(guān)［7-8］。然而，miR-132 對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是否具有保護作用尚不清楚［9］。2021 年9 月至2022 年3 月，筆者使用PC12 細胞建立了谷氨酸細胞損傷模型，以研究miR-132 對缺血性卒中的保護作用。

材料與方法

1、細胞與試劑

本實驗所使用的PC12 細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫。Lipofectamine 3000 購于美國Invitrogen 公司，實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR）試劑盒購于日本TaKaRa 公司，TRIzol 試劑來于美國Thermo Fisher Scientific 公司，RIPA 細胞裂解液、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司，CCK8試劑盒購于南京凱基生物技術(shù)有限公司，青霉素、鏈霉素購于Gibco BRL公司，熒光素酶檢測試劑購自Promega 北京生物技術(shù)有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司。miR-132 mimic（5'-ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU-3'），miR-negative control（NC） of the mimic（5'-CAGGUAAUCAACGCGGAGGUCA-3'）。

2、RNA表達檢測

收集細胞，采用TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實時熒光定量PCR 法檢測RNA 表達情況。本研究使用的引物序列：hsa-miR-132-3p forward，5'-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3'及5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGACCGACCATG-3'；U6-F為5'-GGTCACAGTGAACCGGTC-3'，U6-R為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

反應(yīng)參數(shù)：90～95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，PCR 進行30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，反應(yīng)體系為20 μl，以U6 為內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

3、細胞活力檢測

采用CCK-8 法測定細胞活力。取對數(shù)生長期的PC12 細胞，加入DMEM 培養(yǎng)基，接種于96 孔板中（密度為1×105/ml），移 除細胞培養(yǎng)基，使用PBS 洗2 次，分別采用瞬時轉(zhuǎn)染法將miR-132 mimics（濃度分別為200、100、50 nmol/L）及NC mimics（濃度分別為200、100、50 nmol/L）轉(zhuǎn)染入PC12 細胞，轉(zhuǎn)染8 h 后去除轉(zhuǎn)染液，加入1 ml OPTI-MEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h 及48 h。在熒光顯微鏡下觀察示，轉(zhuǎn)染效率達90%以上，表明轉(zhuǎn)染條件可靠。加入10%CCK8。37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀測定光密度值（試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm）。細胞相對增殖率（%）=［（B-A）/B×100%］，A 為miR-132 mimics或NCmimics轉(zhuǎn)染組OD值，B 為對照組OD 值。每個實驗重復(fù)3 次，每次測量3次。

4、炎癥因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6表達。按上述miR-132 mimics瞬時轉(zhuǎn)染步驟進行瞬時轉(zhuǎn)染，使miR-132 mimics終濃度為200 nmol/L，另設(shè)NC mimics 組（終濃度為100 nmol/L）、對照組，胰酶消化各組細胞后加入細胞裂解液（RIPA）50 μl 裂解細胞提取總蛋白，采用Bradford 方法進行蛋白定量。采用SDS-PAGE電泳分離總蛋白，每道孔上樣50 μg 總蛋白質(zhì)，電泳2 h 后，采用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗（1∶1 000 稀釋）過夜，次晨采用TBST 漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3 000稀釋），37 ℃孵育1 h，ECL 顯影，保存圖像，以β-actin 為對照，采用Quantity One測光密度值。實驗重復(fù)3次。

5、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用LSD-t 檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1、谷氨酸處理后PC12細胞miR-132表達變化

使用谷氨酸處理后PC12 細胞后，谷氨酸組相對于對照組表達明顯下調(diào)（P<0.05），表達空載體NC mimics 之后，miR-132 無明顯改變，轉(zhuǎn)染miR-132 mimics 后，miR-132 表達相對于對照組明顯上調(diào)（P<0.05）。見圖1。

圖1 使用谷氨酸處理后PC12 細胞后miR-132 的相對表達量

2、谷氨酸對PC12細胞活力的影響

CCK8檢測結(jié)果顯示，與0mM組相比，PC12細胞存活率隨著谷氨酸濃度（0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mM）增高而降低，呈一定的濃度依賴性。當(dāng)谷氨酸濃度為2.00 mM 時，PC12 細胞存活率為（48.02±5.24）%，顯著低于0 mM 組（P<0.01）。因此，選擇濃度為2.00 mM 的谷氨酸處理進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖2 使用谷氨酸處理后PC12細胞后細胞活力變化

3、轉(zhuǎn)染miR-132后PC12細胞活力比較

CCK8 結(jié)果顯示，與對照組相比，谷氨酸組細胞存活率明顯降低（P<0.05），而谷氨酸+miR-132 組細胞存活率較谷氨酸組明顯升高（P<0.01），表明miR-132 可明顯改善谷氨酸損傷的PC12細胞活性。見圖3。

圖3 使用谷氨酸處理后PC12細胞后，過表達miR-132后細胞活力變化

4、轉(zhuǎn)染miR-132后PC12細胞氧化應(yīng)激水平比較

為進一步檢測miR-132 對PC12 細胞的保護作用，我們檢測了ROS 及MDA 水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，谷氨酸組ROS 水平明顯升高（P<0.01），而谷氨酸+miR-132 組較谷氨酸組明顯降低（P<0.01），表明miR-132 可明顯改善谷氨酸引起的PC12細胞氧化應(yīng)激損傷。見圖4。

圖4 使用谷氨酸處理后PC12細胞后ROS（A）及MDA（B）的變化

5、轉(zhuǎn)染miR-132后PC12細胞炎癥因子水平比較

為進一步檢測miR-132 對PC12 細胞的保護作用，我們檢測了炎癥因子IL-1β 及IL-6 的水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，谷氨酸組IL-1β 平明顯升高（P<0.001），而谷氨酸+miR-132 組炎癥因子表達較谷氨酸組明顯降低（P<0.01），同時，谷氨酸組IL-6 水平明顯升高（P<0.001），而谷氨酸+miR-132 組炎癥因子表達較谷氨酸組明顯降低（P<0.001），表明miR-132 可明顯改善谷氨酸引起的PC12 細胞的炎性反應(yīng)。見圖5。

圖5 使用谷氨酸處理后PC12細胞后IL-6（A）、IL-1β（B）水平的變化

討論

miR 是長20～24 個核苷酸的小非蛋白質(zhì)編碼RNA，可通過堿基配對識別信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR），影響mRNA 穩(wěn)定性或干擾蛋白質(zhì)翻譯，從而調(diào)節(jié)下游靶向基因的表達，影響許多生理和病理過程［10］。此外，miR 分泌到體液中，或可作為新型診斷、預(yù)后和治療生物標(biāo)志物［11］。目前，血液中的miR 在腦卒中及神經(jīng)細胞保護等方面的作用仍有待研究。

越來越多的證據(jù)表明，例如卒中后的細胞增殖、造血、代謝及免疫功能。最新研究顯示，卒中后患者miR 表達異常，miR 是缺血性卒中的病因和病理方面的關(guān)鍵介體。循環(huán)中的miR 不僅可監(jiān)測治療過程中的反應(yīng)，同時可幫助判斷預(yù)后。研究證據(jù)表明，卒中患者與健康者相比，循環(huán)中各種miR 的水平可能有所不同。最近，有研究表明卒中患者循環(huán)中的miR-335 相對于正常人下調(diào)。研究指出miR-335 的表達與血漿CaM 呈負相關(guān)，而細胞內(nèi)鈣的增加與中風(fēng)的進展有關(guān)［12］。

已有研究表明，miR-132 與細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程密切相關(guān)。同時也有研究表明，miR-132 在卒中患者中表達上調(diào)，但miR-132 是否對卒中后的細胞損傷具有作用未有定論。先前的研究表明，轉(zhuǎn)染miR-132 模擬物增加MAP2 標(biāo)記的樹突突起、Tau 標(biāo)記的軸突突起和NF200 標(biāo)記的神經(jīng)纖維的長度［9］。這些結(jié)果表明，miR-132 的上調(diào)促進了神經(jīng)可塑性。為進一步研究miR-132 的神經(jīng)保護作用，本研究表明，經(jīng)谷氨酸處理后的PC12 細胞的miR-132 表達明顯上調(diào)，與此前的報道一致，提示miR-132可能對卒中后的細胞損傷具有重要作用。進一步的數(shù)據(jù)顯示，谷氨酸可使細胞活力下降，而轉(zhuǎn)染miR-132后，PC12細胞的活力得到明顯改善。

為研究miR-132 在卒中后細胞損傷的作用機制，我們檢測了谷氨酸處理后的炎癥因子，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-132 后的PC12 細胞，神經(jīng)炎癥因子較谷氨酸組明顯下調(diào)，提示miR-132 可能是通過改善神經(jīng)炎癥保護卒中后的細胞損傷。

氧化應(yīng)激在卒中后的神經(jīng)損傷中具有重要作用［13］。因此，我們檢測了谷氨酸處理后的氧化應(yīng)激水平，結(jié)果提示，谷氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可被miR-132 減輕。由此提示，miR-132 對卒中后細胞損傷的作用可能與改善氧化應(yīng)激相關(guān)。

綜上所述，谷氨酸處理后的miR-132表達量明顯降低，同時miR-132 可改善PC12 細胞谷氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及神經(jīng)炎癥，從而起到保護PC12神經(jīng)細胞的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突