司鑫鑫，張 曉，付 免，李婷婷，馬衛(wèi)興

(江蘇海洋大學藥學院，江蘇 連云港 222005)

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)一種重要的高分子有機物，是由氨基酸通過肽鍵連接而成的含氮高分子化合物。蛋白質(zhì)的含量測定是生物化學分析的一項基礎(chǔ)工作，也與食品、營養(yǎng)、醫(yī)藥、化工材料等領(lǐng)域的研究密切相關(guān)。目前蛋白質(zhì)的含量測定方法較多，不同種類蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)等不同，應選擇適宜的并經(jīng)方法學驗證的含量測定方法，常見的如凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、考馬斯亮藍法、紫外吸收法等。

人血白蛋白(albumin)是人血漿含量最多的蛋白質(zhì)，作為一種從健康人血液中提取的藥物制劑，臨床主要用于增加循環(huán)血容量和維持體內(nèi)膠體滲透壓。其作為一種靜脈輸注藥物可直接注入人體，在臨床應用廣泛，主要用于治療急癥患者，例如嚴重失血創(chuàng)傷、嚴重燒傷引起的低血容量休克、腦水腫或肝硬化及腎臟疾病引起的水腫或腹水等[1-2]。由于該血液制品的來源特殊，對于制劑中白蛋白含量的檢測及整體制劑質(zhì)量的控制要求和相應的檢測效率要求逐漸增加。其中，蛋白含量是人血白蛋白等血液制品的關(guān)鍵性生化指標[3]?！吨袊幍洹?015版通則0731明確了人血白蛋白產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的測定方法，目前，國內(nèi)被《中國藥典》收載的用于人血白蛋白蛋白質(zhì)含量的檢測方法主要有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮脲法、考馬斯亮藍法、紫外分光光度法等5種[4]。此外，本文搜集整理了近幾年有關(guān)人血白蛋白含量測定的文獻，并對這些方法進行了分析，按人血白蛋白的不同特性進行了歸類整理，最終匯總得到了基于人血白蛋白的光學特性、配位特性、離子特性、分解特性、密度特性、免疫特性等而建立的六大類分析方法。

蛋白質(zhì)類藥物分析是生物藥物分析課程的重要組成部分之一，其內(nèi)容邏輯性強、知識量大，學生普遍反映學習難度較大。教學工具的不斷改進與實踐，在提高教學效果方面發(fā)揮著重要作用。思維導圖教學法作為一種新型教學模式，是一種符合人類大腦記憶空間的放射性特點的創(chuàng)新教學手段，可由一個中心主題連接相關(guān)聯(lián)的各級主題，逐級向外擴展，圖文并茂地展示主題，有助于制定更加科學合理的學習方案[5]。本研究將思維導圖引入生物藥物分析課程教學，以“蛋白質(zhì)類藥物-人血白蛋白的含量測定”教學內(nèi)容為例，借助思維導圖對教學內(nèi)容進行立體設(shè)計，構(gòu)建了層次分明的知識框架，構(gòu)建了人血白蛋白基于光學特性、配位特性、離子特性、分解特性、密度特性、免疫特性等特性而建立的分析方法(圖1)，將瑣碎、繁雜的知識點串聯(lián)起來，幫助學生理解和記憶，激發(fā)學生學習興趣，提高學生發(fā)散性思維能力，顯著提高教學效果，值得推廣。

圖1 構(gòu)建人血白蛋白含量測定方法的思維導圖Fig.1 Mind map of human serum albumin content determination method

1 光學特性

1.1 吸光特性

人血白蛋白是人血漿中的一種蛋白質(zhì)，氨基酸是組成蛋白質(zhì)的最小單位，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈，是一條或多條多肽鏈組成一個蛋白質(zhì)生物大分子。人血白蛋白由585個氨基酸組成的一條多肽鏈，其中蛋白質(zhì)組成中含有芳香氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，這些芳香氨基酸中的芳環(huán)具有紫外吸光特性，利用這一吸光特性可建立紫外分光光度法用于人血白蛋白含量測定[6]。人血白蛋白最大吸收波長在280 nm處，其濃度在0.2～2 mg/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于人血白蛋白制劑含量測定[7]。基于人血白蛋白的上述紫外吸收特性，結(jié)合高效液相色譜的分離功能，采用Hi-Pore RP-318型蛋白柱，流動相為pH 6.4的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，檢測波長為280 nm，可用于人血白蛋白的定量分析[8]。

1.2 旋光特性

旋光度法測定蛋白含量主要是基于當平面偏振光通過含有某些光學活性物質(zhì)的液體或溶液時，能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的振動平面向左或向右旋轉(zhuǎn)。人血白蛋白為左旋性物質(zhì)，使用241MC-旋光儀，采用鈉光譜D線，波長589 nm，測定管長1 dm，室溫下測定，在濃度40～200 mg/mL與旋光度值呈良好的線性關(guān)系，可依據(jù)標準品濃度對旋光度的回歸方程計算人血白蛋白的含量[9]。

1.3 折光特性

折光率法與旋光度法一樣也是早期用于檢測蛋白質(zhì)含量的一種方法。折光率是物質(zhì)的一種物理常數(shù)，不同的物質(zhì)具有不同的折光率，人血白蛋白作為一種生物大分子，具有自己特定的折光率。使用WYY-1型醫(yī)用折射儀，人血白蛋白濃度在5.0～20.0 g/dL時線性關(guān)系良好，可依據(jù)標準品濃度對旋光度的回歸方程計算人血白蛋白的含量[10]。

2 配位特性

人血白蛋白的多肽鏈含有585個氨基酸，通過肽鍵(-CO-NH-)連接而形成具有類似雙縮脲結(jié)構(gòu)的特性，具有配位特性，在堿性溶液中與二價銅離子形成紫紅色絡合物，在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，以對照品溶液作標準曲線， 采用比色法即可測定供試品中人血白蛋白含量，可用于人血白蛋白注射液的含量測定[11]，中國藥典2015年版三部也是采用本法進行檢測。

3 離子特性

由于蛋白質(zhì)表面離子化側(cè)鏈的存在，蛋白質(zhì)帶凈電荷，每個蛋白都存在一個pH使它的表面凈電荷為零即等電點，因此蛋白質(zhì)在溶液中有兩性電離現(xiàn)象[12]。當?shù)鞍椎入婞c(pI)與pH值相等時，該蛋白質(zhì)極性基團解離的正負離子數(shù)相等，凈電荷為0。在某一pH溶液中當pH>pI時該蛋白質(zhì)帶負電荷，反之pH

人血白蛋白也具有特定等電點，在較高pH下羧基解離成為人血白蛋白陰離子，在較低pH下氨基質(zhì)子化形成質(zhì)子化的人血白蛋白陽離子。在酸性條件下人血白蛋白陽離子可與馬斯亮藍G-250進行離子締合形成藍色締合物，在595 nm處有吸收峰，人血白蛋白含量在5～25 μg范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于人血白蛋白制劑含量測定[14]。

4 分解特性

人血白蛋白與其它蛋白質(zhì)一樣，是含氮有機生物大分子，可與濃硫酸和催化劑一同加熱消化分解產(chǎn)生硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，并換算成人血白蛋白含量，即含氮量*6.25=蛋白含量，這種方法就是凱氏定氮法。凱氏定氮法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法，常將本法作為人血白蛋白含量測定的標準方法，用于新方法學開發(fā)的評價比較[15-16]。

5 密度屬性

人血白蛋白具有密度屬性，可用密度儀測定血液制品中的人血白蛋白含量[13-14]，即不同濃度的人血白蛋白溶液具有特定的密度，通過測定供試品密度的物理性質(zhì)，建立一種密度與人血白蛋白含量的關(guān)聯(lián)，可用于人血白蛋白制劑的含量測定[17]，使用密度儀測定時樣品不需稀釋， 適合于高濃度人血白蛋白含量檢測。

6 免疫特性

人血白蛋白具有免疫特性，將人血白蛋白視作抗原，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種高靈敏度的雙抗體夾心試驗技術(shù)，可用于測定人血白蛋白含量[18]。該方法的大致流程包括，將人血白蛋白抗體結(jié)合到固相載體，將待測抗原與之反應，再加入相應的酶標記抗體，最后加酶底物的顯色液，顏色深淺和樣品中蛋白含量呈線性關(guān)系(0～0.39 mg/mL)，從而實現(xiàn)定量檢測[19-20]。

7 結(jié) 語

不同種類蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)等不同，應選擇適宜的并經(jīng)方法學驗證的測定方法。人血白蛋白具有多種特性，本研究借助思維導圖這種可視化、簡單易用的有效的教學工具，總結(jié)了基于光學特性、配位特性、離子特性、分解特性、密度屬性和免疫特性而建立的不同的分析方法，可為設(shè)計人血白蛋白含量檢測方法的教學分析提供新思路，適合于生物藥物分析課程的特點，值得在今后的其他生物藥物分析教學中進一步推廣應用。