袁先鈴，周鶯茹，鄭連強(qiáng)

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

四川酸菜主要是以芥菜作為加工原料，通過(guò)乳酸菌和酵母菌等微生物發(fā)酵而成的一種發(fā)酵類(lèi)食品，在四川簡(jiǎn)稱(chēng)鹽漬青菜[1-2]。據(jù)史冊(cè)記載，酸菜的制作工藝已有440多年的歷史[3]。在發(fā)酵技術(shù)的研究中，歐洲的科研工作者首先開(kāi)發(fā)出乳酸菌純種發(fā)酵技術(shù)，比如加拿大的考德威爾生物發(fā)酵公司率先獲得了酸菜發(fā)酵菌株專(zhuān)利技術(shù)[4]；國(guó)內(nèi)對(duì)酸菜的研究主要是應(yīng)用微生物純培養(yǎng)技術(shù)，比如乳桿菌的分離篩選等。傳統(tǒng)自然發(fā)酵依賴(lài)于單一的乳酸菌發(fā)酵[5]，從純種乳酸菌發(fā)酵技術(shù)再到直投式乳酸菌發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，更加明確了酸菜發(fā)酵過(guò)程中微生物的作用；技術(shù)的發(fā)展縮短了酸菜發(fā)酵的時(shí)間；改善了酸菜的風(fēng)味、質(zhì)地；提高了酸菜的食用安全[6-8]。吳鈺清等[9]以崇左江州鎮(zhèn)保安酸菜為試驗(yàn)原料，發(fā)現(xiàn)用0.04%氯化鈣處理酸菜30 min，在4 ℃下真空保藏，酸菜的脆度最佳。趙金海等[10]研究得出酸菜在發(fā)酵劑添加量為3%，菌種比例(腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌)為1∶2，發(fā)酵溫度為20 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16 d的酸菜有光澤，無(wú)異味，酸味純正柔和，略帶甜味，清脆可口。張玉龍等[11]采用明串珠菌和乳酸桿菌復(fù)配出酸菜發(fā)酵劑，接入到自然發(fā)酵酸菜中進(jìn)行發(fā)酵，取得了良好的酸菜成品。

本試驗(yàn)以從自然發(fā)酵酸菜中篩選出的植物乳桿菌和類(lèi)干酪乳桿菌為研究目標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)酸菜進(jìn)行工藝優(yōu)化，其成果對(duì)促進(jìn)和加快酸菜這一傳統(tǒng)食品的現(xiàn)代化生產(chǎn)，縮短酸菜的生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，改善酸菜的風(fēng)味和提高酸菜的質(zhì)量、工業(yè)經(jīng)濟(jì)效益等均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥菜：購(gòu)于成都農(nóng)家市場(chǎng)。

目標(biāo)菌：A6植物乳桿菌、A8類(lèi)干酪乳桿菌菌株(從自然發(fā)酵酸菜中分離所得菌株)。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250E生化培養(yǎng)箱 上海培因試驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Legend Micro 17離心機(jī) ThermoFisher Scientific公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；泡菜壇子 景德鎮(zhèn)市承啟陶瓷有限公司；電磁爐 深圳綠智電磁爐有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵酸菜的制作

發(fā)酵酸菜制作工藝：白菜整理→清洗→切分→稱(chēng)量→熱燙→冷卻→入缸→注入鹽水→人工接種→密封→發(fā)酵→成品。

1.3.2 菌株接種量的選擇

以食鹽濃度為2%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為20 d，菌種比例植物乳桿菌∶類(lèi)干酪乳桿菌為1∶1，設(shè)置接種量為5%、6%、7%、8%、9%、10%進(jìn)行乳酸菌酸菜發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.3 發(fā)酵時(shí)間的選擇

以食鹽濃度為2%，接種量為8%，發(fā)酵溫度為30 ℃，菌種比例植物乳桿菌∶類(lèi)干酪乳桿菌為1∶1，發(fā)酵時(shí)間分別為5，10，15，20，25，30 d進(jìn)行乳酸菌酸菜發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.4 鹽水濃度的選擇

以發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為20 d，接種量為8%，菌種比例植物乳桿菌∶類(lèi)干酪乳桿菌為1∶1，設(shè)置鹽水濃度為2%、3%、4%、5%、6%、7%進(jìn)行乳酸菌酸菜發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.5 發(fā)酵溫度的選擇

以食鹽濃度為2%，接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間為20 d，菌種比例植物乳桿菌∶類(lèi)干酪乳桿菌為1∶1，設(shè)置發(fā)酵溫度為15，20，25，30，35 ℃進(jìn)行乳酸菌酸菜發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.6 發(fā)酵酸菜條件優(yōu)化

最佳發(fā)酵條件因素水平表見(jiàn)表1。

表1 最佳發(fā)酵條件因素水平表Table 1 The factors and levels of optimal fermentation conditions

以試驗(yàn)所分離篩選的菌株作為添加菌株，將菌株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，采用蔬菜培養(yǎng)基：分別取新鮮番茄、青瓜和包菜，清洗后在粉粹機(jī)中粉粹，用6層濾布過(guò)濾，濾液即為相應(yīng)的蔬菜培養(yǎng)基，滅菌后備用。包菜汁與青瓜汁配比為2∶1時(shí)適宜植物乳桿菌生長(zhǎng)；類(lèi)干酪乳桿菌采用包菜汁∶胡蘿卜汁∶番茄汁為1∶1∶1時(shí)適宜生長(zhǎng)[12]。

綜合參考文獻(xiàn)[13-14]，依據(jù)試驗(yàn)1.3.2選擇最佳接種量，依據(jù)試驗(yàn)1.3.3選擇最佳發(fā)酵時(shí)間，依據(jù)試驗(yàn)1.3.4選擇最佳鹽水濃度，依據(jù)試驗(yàn)1.3.5選擇最佳發(fā)酵溫度。采用L9(34)正交試驗(yàn)，按酸菜發(fā)酵工藝流程接種發(fā)酵。酸菜發(fā)酵所用的容器為泡菜壇子，體積為1.2 L，裝菜量大約為0.25 kg，加水約0.5 L，壇口水封。菌種比例為1∶1，同時(shí)設(shè)置不接種作為對(duì)照[15]。按照正交試驗(yàn)表(見(jiàn)表2)逐一進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵完成后測(cè)定pH和乳酸菌菌落數(shù)。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

表2 最佳發(fā)酵條件正交試驗(yàn)表Table 2 The orthogonal test of optimal fermentation conditions

1.3.7 優(yōu)化后酸菜成品感官評(píng)價(jià)

酸菜感官評(píng)價(jià)：邀請(qǐng)10名食品專(zhuān)業(yè)的研究生擔(dān)任評(píng)審員，各取發(fā)酵30 d的樣品25 g，按照感官評(píng)定表(見(jiàn)表3)給酸菜成品打分，滿分100分[16]。

表3 酸菜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Table 3 The sensory evaluation criteria of pickles

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜發(fā)酵菌液pH值變化

在20，25，30 ℃的發(fā)酵溫度下，不同菌株引起酸菜發(fā)酵液pH值在20 d的變化見(jiàn)圖1。

a.20 ℃時(shí)pH值的變化

b.25 ℃時(shí)pH值的變化

c.30 ℃時(shí)pH值的變化

由圖1可知，20，25，30 ℃發(fā)酵時(shí)，接入乳酸菌的酸菜均比未接入乳酸菌的酸菜pH值下降快，植物乳桿菌和類(lèi)干酪乳桿菌發(fā)酵酸菜的發(fā)酵液pH值變化均較小，比未接入菌株的pH值低，平衡后最終pH值為3.13和3.14。

自然發(fā)酵泡菜的發(fā)酵過(guò)程分為3個(gè)發(fā)酵階段：初期發(fā)酵階段、中期發(fā)酵階段和后期發(fā)酵階段。自然發(fā)酵酸菜在0～5 d時(shí)pH值下降較慢，在發(fā)酵5～10 d時(shí)pH值下降迅速，而在10～20 d時(shí)pH值下降非常緩慢，其變化可能是在發(fā)酵初期有少量乳酸菌，優(yōu)勢(shì)菌為好氧菌和酵母菌，這兩種菌對(duì)乳酸菌的繁殖有抑制作用，從而使pH值變化小；發(fā)酵中期，乳酸菌變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌，pH值下降較快；而當(dāng)進(jìn)入末期，乳酸菌繁殖進(jìn)入穩(wěn)定期，使pH值下降較慢。人工接種乳酸菌使發(fā)酵酸菜沒(méi)有初期，直接進(jìn)入發(fā)酵中期，接入乳酸菌發(fā)酵減少了發(fā)酵初期，使發(fā)酵時(shí)間縮短，同時(shí)產(chǎn)酸抑制其他菌的生長(zhǎng)。

2.2 接種量的選擇

不同接種量酸菜發(fā)酵液pH值隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖2。

圖2 不同接種量酸菜發(fā)酵液pH值的變化Fig.2 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles with different inoculation amount

由圖2可知，在5～20 d時(shí)不同接種量酸菜發(fā)酵液均呈下降趨勢(shì)，但在5～10 d時(shí)，接種量為8%的發(fā)酵液pH值變化較其他接種量更顯著，而在20 d后均趨于平緩。感官分析酸菜顏色透明，菜幫顏色良好，風(fēng)味純正。

2.3 發(fā)酵時(shí)間的選擇

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間酸菜發(fā)酵液pH值的變化Fig.3 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles at different fermentation time

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸菜的pH值逐漸降低，在5～15 d時(shí)變化最明顯，呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵20 d時(shí)，pH值達(dá)到最低，為3.11，感官分析酸菜顏色透明，菜幫顏色均一，風(fēng)味純正。20 d后基本持平，當(dāng)發(fā)酵25 d時(shí)，pH值為3.12，菜幫顏色變暗；發(fā)酵30 d時(shí)pH值為3.13，感官分析發(fā)酵30 d時(shí)酸菜口感過(guò)酸，質(zhì)地變軟，顏色發(fā)暗，表明發(fā)酵過(guò)度。

2.4 鹽水濃度的選擇

不同鹽水濃度酸菜發(fā)酵液的pH值隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖4。

圖4 不同鹽水濃度酸菜發(fā)酵液pH值的變化Fig.4 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles with different brine concentrations

由圖4可知，鹽水濃度為4%時(shí)，發(fā)酵液的pH值下降最顯著，且在20 d時(shí)pH值最低，達(dá)到了3.13，而鹽水濃度為7%時(shí)，pH值在10～25 d時(shí)變化緩慢，在發(fā)酵30 d時(shí)，pH值略微增加，感官分析酸菜顏色變黑，菜葉有腐爛，菜幫沒(méi)有脆性。

2.5 發(fā)酵溫度的選擇

圖5 不同發(fā)酵溫度酸菜發(fā)酵液pH值的變化Fig.5 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles at different fermentation temperatures

由圖5可知，pH值隨著發(fā)酵溫度的變化呈先下降后上升的趨勢(shì)，酸菜發(fā)酵液在30 ℃發(fā)酵過(guò)程中pH值下降速度更快，原因在于乳酸菌的最適宜生長(zhǎng)溫度為30 ℃。因此，在30 ℃時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)繁殖快，產(chǎn)酸量大。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，極差分析結(jié)果見(jiàn)表4和表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

2.6.1 不同因素水平下的pH值

不同因素水平下的pH值見(jiàn)表4。

表4 不同因素水平下的pH值Table 4 The pH values at different factors and levels

由表4可知，影響pH值的各因素主次順序?yàn)镈>A>C>B，即溫度對(duì)酸菜pH值的影響最大，而發(fā)酵時(shí)間的影響最小。最優(yōu)水平為A2B2C3D2，即以pH值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，酸菜發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件為：接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間為20 d，鹽水濃度為5%，發(fā)酵溫度為30 ℃。由于最優(yōu)水平不在試驗(yàn)組中，選取最佳發(fā)酵條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，所得的pH值的平均值為3.04。證明正交試驗(yàn)條件：接種量8%、發(fā)酵時(shí)間20 d、鹽水濃度5%、發(fā)酵溫度30 ℃為最優(yōu)水平。

2.6.2 不同因素水平下酸菜乳酸菌菌數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

不同因素水平下乳酸菌菌數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同因素水平下酸菜乳酸菌菌數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The orthogonal test results of lactic acid bacteria count of pickles under different factors and levels

由表5可知，影響酸菜乳酸菌菌數(shù)的各因素主次順序?yàn)镈>A>B>C，即發(fā)酵溫度對(duì)酸菜發(fā)酵后乳酸菌菌數(shù)的影響最大，而鹽水濃度的影響最小。最優(yōu)水平為A2B2C1D2，即以乳酸菌菌數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，酸菜發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件為：接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間為20 d，鹽水濃度為3%，發(fā)酵溫度為30 ℃。由于最優(yōu)水平不在試驗(yàn)組中，選取最佳發(fā)酵條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，所得的乳酸菌菌數(shù)的平均值為8.3×102CFU/mL。證明正交試驗(yàn)條件：接種量8%、發(fā)酵時(shí)間20 d、鹽水濃度3%、發(fā)酵溫度30 ℃為最優(yōu)水平。

表6 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 6 The results of variance analysis of orthogonal experiment

續(xù) 表

由表6可知接種量、發(fā)酵時(shí)間、鹽水濃度、溫度對(duì)pH值、乳酸菌菌數(shù)測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)pH值和乳酸菌菌數(shù)具有顯著影響。

2.6.3 最佳發(fā)酵工藝條件的確定

從pH值和乳酸菌菌數(shù)這兩個(gè)指標(biāo)綜合考慮，所確定的最佳接種量、最佳發(fā)酵時(shí)間以及最佳發(fā)酵溫度均一致，分別為8%、20 d及30 ℃，而在鹽水濃度上有差異，若以pH值為篩選指標(biāo)，鹽水濃度為5%；若以乳酸菌菌數(shù)為篩選指標(biāo)，則鹽水濃度為3%。發(fā)酵試驗(yàn)表明，鹽水濃度為3%的酸菜產(chǎn)品比鹽水濃度為5%的口感要好。

因此，綜合考慮pH值、乳酸菌菌數(shù)和實(shí)際酸菜發(fā)酵成品的口感，最終確定選擇最佳發(fā)酵條件A2B2C1D2：接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間20 d，鹽水濃度3%，發(fā)酵溫度30 ℃。所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵酸菜的最佳工藝條件：接種量為8%，菜水比為1∶2，菌種比例植物乳桿菌∶類(lèi)干酪乳桿菌為1∶1，菌種培養(yǎng)基為蔬菜培養(yǎng)基，食鹽濃度為3%，30 ℃發(fā)酵20 d。

2.7 酸菜成品的感官評(píng)價(jià)

自然發(fā)酵酸菜與接種發(fā)酵酸菜評(píng)分見(jiàn)表7，對(duì)比可以看出，正交試驗(yàn)接種發(fā)酵酸菜的感官評(píng)分為88.7，自然發(fā)酵酸菜的感官評(píng)分為73.1；正交試驗(yàn)接種發(fā)酵酸菜的感官評(píng)分高于自然發(fā)酵酸菜。自然發(fā)酵酸菜有少量發(fā)生腐爛，且有難聞的氣味；而優(yōu)化后發(fā)酵酸菜樣品色澤都良好，均優(yōu)于自然發(fā)酵酸菜，這與王旭丹[17]研究直投式酸菜發(fā)酵劑發(fā)酵酸菜優(yōu)于自然發(fā)酵酸菜的感官品質(zhì)一致，外觀淺黃色，發(fā)酵液澄清微黃。自然發(fā)酵酸菜發(fā)生腐爛的原因是芥菜中含有少量的乳酸菌，生長(zhǎng)繁殖較慢，發(fā)酵過(guò)程中難免會(huì)有腐敗菌產(chǎn)生并且快速繁殖，從而抑制乳酸菌的繁殖。

表7 酸菜樣品感官評(píng)價(jià)得分Table 7 The sensory evaluation scores of pickle samples

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵酸菜中得到A6植物乳桿菌和A8類(lèi)干酪乳桿菌兩株乳酸菌，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，綜合考慮pH值、乳酸菌菌數(shù)和實(shí)際酸菜發(fā)酵成品的口感，得到最佳發(fā)酵工藝條件：接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間為20 d，食鹽濃度為3%，發(fā)酵溫度為30 ℃，菜水比為1∶2，菌種比例植物乳桿菌∶類(lèi)干酪乳桿菌為1∶1。在此優(yōu)化條件下，將優(yōu)化后的酸菜與自然發(fā)酵酸菜進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的酸菜在色澤、香氣、滋味和脆度4個(gè)方面均要高于自然發(fā)酵酸菜。本研究為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酸菜提供了有益參考。