許春平，王宣靜，高明奇，張弛，楊雯靜，邢雨晴，朱麗，黃家樂，郝輝*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001; 2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州 450016)

羅漢果，又名長(zhǎng)壽果，廣泛分布于廣西、江西、湖南、廣東、貴州等地，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)、藥用植物，被列為“藥食同源”品種，果實(shí)中含有豐富的葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂類等[1]，具有止咳祛痰、抑菌、抗氧化等藥理作用, 被廣泛開發(fā)為食品、保健食品和藥品。

美拉德反應(yīng)發(fā)生在羰基化合物和氨基化合物間，是目前較為流行的一種香料生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)，在食品、醫(yī)藥和香料等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2-3]。糖類在高溫條件下熔融經(jīng)過一系列反應(yīng)變?yōu)楹诤稚镔|(zhì)的過程，稱為焦糖化作用[4-5]。在酸、堿條件下均可進(jìn)行，糖在強(qiáng)熱的情況下生成兩類物質(zhì):一類是糖的脫水產(chǎn)物，即焦糖或醬色；另一類是裂解產(chǎn)物，即一些揮發(fā)性的醛、酮類物質(zhì)，它們進(jìn)一步縮合、聚合，最終形成深色物質(zhì)。

目前，關(guān)于羅漢果的研究多集中于其生物活性成分方面[6-7]，本研究通過將羅漢果提取物與葡萄糖焦糖化料液進(jìn)行摻配后進(jìn)行不同溫度的加熱反應(yīng)制備羅漢果香料，通過GC-MS分析及主成分分析對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行探索，結(jié)合嗅香評(píng)價(jià)判斷最優(yōu)的反應(yīng)條件，為羅漢果的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅漢果：購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)桂林市。

試劑：氫氧化鈉、二氯甲烷(AR，滄州天工化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司)；乙酸苯乙酯(色譜純，蘇州鼎亞化工有限公司)；食用葡萄糖(內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司)；無水碳酸鈉、無水硫酸鈉(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠)。

儀器：1000C不銹鋼粉碎機(jī) 永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；TGL-16M離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；集熱式磁力攪拌器、DF-101S油浴鍋 上海予申儀器有限公司；同時(shí)蒸餾萃取裝置 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Agilent GC6890-MS5973N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅漢果提取物的制備

將羅漢果粉碎后過20目篩，準(zhǔn)確稱取200 g羅漢果粉，加入4000 mL水，在60 ℃下攪拌6 h后離心，在濾渣中加入2000 mL水繼續(xù)在60 ℃下攪拌2 h后離心，合并濾液，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到羅漢果提取物52.54 g。

1.2.2 葡萄糖焦糖化料液的制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取100 g無水葡萄糖，加入糖質(zhì)量20%的無水碳酸鈉作為反應(yīng)助劑，加入250 mL水，超聲攪拌均勻后在160 ℃的油浴鍋中加熱30 min，制備焦糖化料液。

1.2.3 摻配料進(jìn)行加熱反應(yīng)

將羅漢果提取物與葡萄糖焦糖化料液按3∶1的比例進(jìn)行摻配，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH為7，將摻配料分為5份并標(biāo)號(hào)A、B、C、D、E，在油浴鍋中進(jìn)行加熱反應(yīng)，時(shí)間設(shè)置為1 h，對(duì)應(yīng)溫度分別設(shè)置為80，100，120，140，160 ℃。

1.2.4 萃取香味物質(zhì)

加熱反應(yīng)結(jié)束后，各取1 mL反應(yīng)物加入30 mL二氯甲烷，超聲萃取1 h，在50 mL分液漏斗中靜置30 min，分液后在二氯甲烷萃取液中加入10 g無水硫酸鈉，然后在35 ℃的水浴鍋中進(jìn)行濃縮，濃縮后用注射器過孔徑為0.22 μm的有機(jī)濾膜轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)樣品瓶中，加入50 μL濃度為0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(內(nèi)標(biāo)物)，以備GC-MS分析。以內(nèi)標(biāo)法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。揮發(fā)性物質(zhì)含量(μg/mL)=[內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量(μg)×揮發(fā)性物質(zhì)峰面積]/[內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品體積(mL)][8]。

1.2.5 GC-MS條件

GC條件：色譜柱：HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm)；載氣(He)流速3 mL/min；進(jìn)樣量 1 μL；升溫程序： 50 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；分流比：10∶1。

MS條件：EI離子源；離子源溫度270 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃；采集模式：Scan；掃描范圍：35～550 m/z。

1.2.6 主成分分析方法

采用軟件IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行檢驗(yàn)，采用PCA統(tǒng)計(jì)建立樣品與各揮發(fā)性組分之間的關(guān)系。

1.2.7 嗅香評(píng)價(jià)

準(zhǔn)確稱取1 g羅漢果提取物，用5 mL去離子水溶解，溶解后置于密閉的磨口瓶中，由6名受過專業(yè)訓(xùn)練的感官評(píng)定員組成的感官評(píng)定小組進(jìn)行嗅香評(píng)價(jià)，嗅其揮發(fā)性香氣，分辨其香氣特色，評(píng)定其類型、風(fēng)格[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加熱溫度樣品揮發(fā)性成分的GC-MS 結(jié)果分析

5個(gè)樣品的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS 檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 不同加熱溫度樣品揮發(fā)性成分含量Table 1 Content of volatile components in samples heated at different temperatures μg/mL

續(xù) 表

續(xù) 表

由表1可知，5個(gè)樣品已鑒定出的揮發(fā)性成分主要包括醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、烷烴類、烯烴類、酯類、胺類等，A、B、C、D、E樣品的揮發(fā)性物質(zhì)種類分別有25，33，24，20，21種，其中樣品B(反應(yīng)溫度為100 ℃)鑒定出的揮發(fā)性成分種類最多；對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性成分總量依次為437.42，593.45，653.93，733.41，684.36 μg/mL。其中樣品D(反應(yīng)溫度為140 ℃)鑒定出的揮發(fā)性成分含量最多。

其中醛類、酮類、酯類在總含量中占比較大，醛類物質(zhì)的總含量隨著反應(yīng)溫度的升高逐漸升高，5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural,5-HMF)是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下水解產(chǎn)生的一種呋喃類化合物，是焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一[10-12]。章銀良等[13]認(rèn)為美拉德反應(yīng)是5-HMF形成的重要途經(jīng)，并對(duì)酪蛋白-木糖模擬體系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)， 5-HMF的生成量隨著反應(yīng)溫度和時(shí)間的增加相應(yīng)增加，同時(shí)其產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率也相應(yīng)增大。楊楠等[14]將油茶籽進(jìn)行紅外加熱處理后發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，油茶籽內(nèi)5-HMF等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成量逐漸增多。相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，5-HMF形成量隨著反應(yīng)溫度的升高而增加。近年來5-HMF的生物活性受到人們的廣泛關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)5-HMF具有抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶、抗過敏、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等對(duì)人體有益的作用[15-16]。

酮類物質(zhì)、酯類物質(zhì)的總含量隨著反應(yīng)溫度的升高先上升后下降，在140 ℃時(shí)達(dá)到最高。2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮是一種白色結(jié)晶物質(zhì), 低溫下比較穩(wěn)定，加熱后所得到的混合物具有焦甜和融熔黃油的香味[17]。吡喃酮、呋喃酮、烯醇酮等物質(zhì)多為美拉德反應(yīng)的特征產(chǎn)物，一般風(fēng)味閾值較低，對(duì)產(chǎn)物香味有較好影響。 酯類物質(zhì)自身具有果香、花香、蜂蜜香等芳香氣味，還能夠調(diào)和其他物質(zhì)的刺激感和苦味。己二酸二異辛酯略有氣味，屬于增塑劑，雖然在樣品中含量占比較大，但對(duì)整體氣味的貢獻(xiàn)較低。

2.2 主成分分析

利用主成分分析對(duì)不同加熱溫度羅漢果樣品中59種揮發(fā)性成分進(jìn)行分析[18]，得到4種主成分特征值和貢獻(xiàn)率(見表2)、載荷矩陣表(見表3)。

表2 4種主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 2 Characteristic values and contribution rates of four principle components

由表2可知，第1主成分的貢獻(xiàn)率為45.451%, 第2主成分的貢獻(xiàn)率為31.535%, 第3主成分的貢獻(xiàn)率為13.534%，主成分1，2，3的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到90.520%，基本代表了樣品主要揮發(fā)性成分的組成, 反映了原始變量的絕大部分信息, 達(dá)到了降維目的。說明羅漢果中59種揮發(fā)性成分，可以用主成分1，2，3進(jìn)行主成分分析。

表3 主成分載荷矩陣

續(xù) 表

由主成分載荷矩陣表(見表3)可以得出在主成分1中，載荷值較高的正影響揮發(fā)性成分有2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、二十三烷、角鯊烯、17-戊三酮等，載荷值依次是0.982，0.979，0.974，0.969，主要指向酚類、烴類、酮類物質(zhì)；負(fù)影響最大的為六氫-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，載荷值為-0.872。在主成分2中，載荷值較高的正影響揮發(fā)性成分有六氫-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、1-十九碳烯、正二十烷、17-戊三酮等物質(zhì)，載荷值依次是0.427，0.351，0.282，0.233，主要指向酮類、烴類物質(zhì)；負(fù)影響最大的為己二酸二(2-乙基己)酯，載荷值為-0.971。在主成分3中，載荷值較高的正影響揮發(fā)性成分有1-[對(duì)溴苯基]-4-硝基-1,3-丁二烯、17-甲基-5-α-雄甾-2-烯-17-β-醇、2,4′-二羥基-3′-甲氧基苯乙酮、8-羥基-2,5-二甲基氫氧化物內(nèi)鹽噻唑[3,2-a]吡啶、O2-丁基O1-(2-甲基丙基)苯-1,2-二羧酸酯等物質(zhì)，載荷值依次是0.288，0.288，0.288，0.288，0.288，主要指向烴類、醇類、酮類、雜環(huán)類等物質(zhì)；負(fù)影響最大的為3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮，載荷值為-0.839。主成分載荷矩陣顯示了各變量與各主成分之間的關(guān)系，數(shù)值的絕對(duì)值越大，表明該指標(biāo)與某一主成分的聯(lián)系緊密程度越大，反映了該指標(biāo)在該主成分上的載荷程度；載荷值小的揮發(fā)性成分對(duì)羅漢果的揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)小，同時(shí)也表明其含量極低或未檢出[19]。

計(jì)算上述多元變量和方差遞減排列得出5個(gè)樣品中的第1、第2、第3主成分值，然后以得分為坐標(biāo)生成旋轉(zhuǎn)空間分散圖見圖1、旋轉(zhuǎn)空間成分圖見圖2。

圖1 不同溫度處理的5個(gè)樣品的旋轉(zhuǎn)空間分散圖Fig.1 Rotational spatial dispersion diagram of five samples treated at different temperatures

圖2 不同溫度處理的5個(gè)樣品的旋轉(zhuǎn)空間成分圖Fig.2 Rotational spatial composition diagram of five samples treated at different temperatures

由圖1可知，5個(gè)樣品根據(jù)距離遠(yuǎn)近可分為3個(gè)區(qū)域，3個(gè)區(qū)域內(nèi)樣品彼此間差異較大，A樣品與E樣品各自分為一個(gè)區(qū)域，B、C、D樣品彼此距離較近分為一個(gè)區(qū)域，表明B、C、D樣品的主成分差異較小。

由圖2可知，對(duì)A樣品特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括17-甲基-5-α-雄甾-2-烯-17-β-醇、正十八烷、正二十四烷等；對(duì)B樣品特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括1-二十二烯、1-十九碳烯、棕櫚酸甲酯等；對(duì)C樣品特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括糠醛、3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、3-甲基二十烷等；對(duì)D樣品特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、香草醛等；對(duì)E樣品特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括2-乙?；量?、糠醇、5-羥甲基糠醛等。

2.3 嗅香評(píng)價(jià)

綜合各評(píng)價(jià)員的嗅香結(jié)果，見表4。

表4 5個(gè)羅漢果樣品嗅香評(píng)價(jià)表Table 4 Olfactory evaluation table of five M. grosvenori samples

GC-MS分析發(fā)現(xiàn)D樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的含量最多，主成分分析發(fā)現(xiàn)D樣品揮發(fā)性物質(zhì)分布較為密集，且多為醛、酮類物質(zhì)。酮類物質(zhì)具有一定的果香味，有研究表明一些酮類物質(zhì)在低閾值時(shí)與醛類或其他物質(zhì)存在相互作用，產(chǎn)生氣味增強(qiáng)或改變的現(xiàn)象[20]。通過嗅香進(jìn)一步分析5個(gè)羅漢果樣品在感官品質(zhì)上的差異性，結(jié)合表4可知，5個(gè)樣品嗅香各不相同，其中D樣品醇厚感較強(qiáng)，嗅覺層次較豐富，甜香、果香、膏香、藥草香明顯，感官品質(zhì)最好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過將羅漢果提取物與葡萄糖焦糖化料液摻配后進(jìn)行不同溫度的加熱反應(yīng)制備羅漢果香料，通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)D樣品(反應(yīng)溫度為140 ℃)中揮發(fā)性物質(zhì)的含量最多，B樣品(反應(yīng)溫度為100 ℃)中揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù)最多。主成分分析發(fā)現(xiàn)主成分1、主成分2、主成分3的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到90.520%，基本代表了樣品主要揮發(fā)性成分的組成,反映了原始變量的絕大部分信息,達(dá)到了降維目的。5個(gè)樣品根據(jù)距離遠(yuǎn)近可分為3個(gè)區(qū)域，3個(gè)區(qū)域內(nèi)樣品彼此間差異較大，A樣品與E樣品各自分為一個(gè)區(qū)域，B樣品、C樣品、D樣品彼此距離較近分為一個(gè)區(qū)域，表明B、C、D樣品的主成分差異較小。D樣品揮發(fā)性物質(zhì)分布較為密集，對(duì)其特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、香草醛等，嗅香分析發(fā)現(xiàn)D樣品(反應(yīng)溫度為140 ℃)中醇厚感較強(qiáng)，嗅覺層次較豐富，甜香、果香、膏香、藥草香明顯，感官品質(zhì)最好。結(jié)合上述結(jié)果可認(rèn)為反應(yīng)溫度為140 ℃時(shí)得到的樣品具有最佳的風(fēng)味和感官品質(zhì)。