米智，劉荔貞，李慧

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學 化學與化工學院，山西 大同 037009)

黃花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)，又稱金針菜、一日百合、忘憂草等，百合科萱草屬多年生宿根草本植物，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用蔬菜之一[1]。又被稱為“四大素山珍”之一，色澤金黃，香味濃郁，味道甘美，營養(yǎng)豐富，含有大量的碳水化合物、維生素、氨基酸、多酚類、類胡蘿卜素、無機礦物質、香精油、黃酮類等多種成分[2-3]?！侗静菥V目》記載黃花菜有利胸膈、安五臟、清身明目、治小便赤澀、解煩熱、除酒瘟、令人好歡無憂等藥效?，F(xiàn)代醫(yī)學認為黃花菜具有抗氧化、抗菌消炎、抗抑郁[4]、鎮(zhèn)靜催眠、平肝養(yǎng)血、消腫利尿、鎮(zhèn)痛、保肝、通乳等保健功能[5-7]。

據(jù)《中藥大辭典》記載，黃花菜含有苷1.8%、黃酮類0.75%、生物堿0.7%、β-胡蘿卜素0.36%[8]。黃花菜中黃酮類化合物是其重要有效成分之一，具有增強免疫力、活血化瘀、保肝抗炎[9]、抗菌抗病毒[10]、抑制腫瘤[11]、延緩衰老[12]、抗氧化[13]、清除自由基等多種保健功能[14-17]，由于其毒副作用較小、功能多等特點，其相關研究和開發(fā)，尤其是黃花菜及其總黃酮在制備抗抑郁藥物領域，日益受到重視。

目前，黃花菜中總黃酮的提取工藝仍以傳統(tǒng)的乙醇法、超聲波法、微波萃取法等方法為主，本文采取的索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設備操作簡便等優(yōu)點，適用于實驗室；黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇無毒且沸點低，適于索氏提取法進行黃花菜中黃酮的提取，且使用乙醇為提取劑具有回收利用方便，提取率較高，有利于降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點[18]。

本文以當年干黃花菜為研究對象，通過單因素實驗與響應面分析的方法，優(yōu)化索氏提取法提取黃花菜黃酮的最佳工藝條件，并采用清除DPPH、ABTS自由基的方法測定其抗氧化活性，以期為黃花菜中黃酮的提取及黃花菜的高值化綜合開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干黃花：購于山西省大同市云州區(qū)萬畝有機黃花種植基地；蘆丁標準品、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、維生素C(VC)：均為分析純，購于上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀(K2S2O8)；C2H5OH；Al(NO3)3；NaNO2；NaOH等。

1.2 儀器與設備

索氏提取器、精密電子天平、電熱恒溫鼓風干燥箱、數(shù)顯控溫電熱套、萬能粉碎機、紫外可見分光光度計、高速冷凍離心機等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的建立

精確稱取蘆丁標準品10 mg，加少許無水乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標準液，參照米智等的方法制作蘆丁標準曲線。

1.3.2 黃花菜處理及黃酮提取工藝流程

選擇色澤鮮艷、長度均勻適中、無發(fā)霉、無損傷、無病蟲害的干黃花菜，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在45～50 ℃下干燥2 h后，用萬能粉碎機粉碎成黃花粉末，并過60目篩，收集黃花菜粉末于干燥的容器中待用。

黃酮提取工藝流程：黃花菜→清選→烘干→粉碎→過篩→稱重→分裝→浸提→定容→測定→計算。

1.3.3 黃花菜黃酮的測定方法

精確量取1 mL浸提液作為待測液，方法同1.3.1，做3組平行實驗求平均值，代入線性回歸方程，得到黃花菜黃酮的含量。黃花菜黃酮提取量的計算公式為：

式中：C為黃花菜黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；W為實驗樣品的質量，g。

1.3.4 黃花菜黃酮提取工藝的單因素實驗

準確稱取2 g黃花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)為90%、料液比為1∶20(g/mL)的條件下，設置提取時間分別為1，1.5，2，2.5，3 h，提取黃花菜中總黃酮，測定提取液吸光值并計算黃酮提取量；在料液比為1∶20(g/mL)、提取時間為2 h的條件下，設置乙醇濃度分別為80%、85%、90%、95%、100%，提取黃花菜中總黃酮，測定提取液吸光值并計算黃酮提取量；在乙醇濃度為90%、提取時間為2 h的條件下，設置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，提取黃花菜中總黃酮，測定提取液吸光值并計算黃酮提取量。

1.3.5 響應面實驗設計及統(tǒng)計學分析

根據(jù)黃花菜黃酮提取工藝的單因素實驗結果，從提取時間(A)、乙醇濃度(B)和料液比(C)3個因素中，分別選取3個對黃花菜黃酮提取量影響較大的水平，以黃酮提取量為考察目標，運用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應面實驗設計，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，確定響應面實驗方案，并建立回歸方程預測模型確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.6 黃花菜黃酮提取工藝的驗證性實驗

為了更好地驗證索氏提取法提取黃花菜黃酮的可靠性和合理性，在響應面實驗結果的基礎上，進行了3次平行驗證性實驗，并計算相對標準偏差(RSD)。

1.3.7 黃花菜黃酮抗氧化性測定

1.3.7.1 黃花菜黃酮對DPPH自由基清除能力測定

根據(jù)響應面實驗，在最優(yōu)條件下提取黃花菜黃酮濃縮液，用無水乙醇配制成0，0.025，0.05，0.075，0.1，0.2 mg/mL的樣品溶液，分別精確量取以上溶液0.6 mL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液2.4 mL，混勻，在黑暗室溫下反應40 min后，在517 nm處測定吸光值[19]。用Vc作為本實驗的參照物，以半數(shù)清除率IC50值作為抗氧化活性評價指標，按照以下公式計算清除率：

式中：A對照為0.6 mL無水乙醇+2.4 mL DPPH溶液；A樣品為0.6 mL黃花菜黃酮待測液+2.4 mL DPPH溶液；A空白為0.6 mL黃花菜黃酮待測液+2.4 mL無水乙醇。

1.3.7.2 黃花菜黃酮對ABTS自由基清除能力測定

精確量取7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混勻，室溫且避光條件下反應12～16 h，形成ABTS自由基離子(ABTS+·)儲備液。測試前，將ABTS+·儲備液用無水乙醇稀釋至在734 nm波長下的吸光值為0.700±0.020，作為ABTS+·工作液于30 ℃保存待用。取黃花菜黃酮濃縮液，用無水乙醇配制成0，0.025，0.05，0.075，0.1，0.2 mg/mL的樣品溶液，分別精確量取以上溶液1 mL，加入ABTS+·工作液6 mL，混勻，在黑暗30 ℃下反應30 min后，在734 nm處測定吸光值[20]。以VC作為本實驗的參照物，以半數(shù)清除率IC50值作為抗氧化活性評價指標，按照以下公式計算清除率：

式中：A對照為1 mL去離子水+6 mL ABTS工作液；A樣品為1 mL黃花菜黃酮待測液+6 mL ABTS工作液；A空白為1 mL黃花菜黃酮待測液+6 mL去離子水。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以不同濃度蘆丁(C，mg/mL)為橫坐標，OD510吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得出線性回歸方程為：y=9.216x-0.102，R2=0.991。

2.2 黃花菜黃酮提取工藝的單因素實驗結果

2.2.1 提取時間對黃花菜黃酮提取量的影響

圖1 提取時間對黃花菜黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由圖1可知，隨著提取時間的延長，黃花菜黃酮提取量逐漸升高，并在2.5 h時黃酮含量達到了最高值，約為0.53%，當提取時間再延長，黃酮提取量略有下降。在做響應面實驗時，選取提取時間為2，2.5，3 h作為3個水平。

2.2.2 乙醇濃度對黃花菜黃酮提取量的影響

圖2 乙醇濃度對黃花菜黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由圖2可知，黃花菜黃酮提取量隨著乙醇濃度的提高而增加，并在90%和95%時達到最大值，均約為0.55%，當用無水乙醇提取時，黃花菜黃酮量反而有所降低?；诠?jié)約成本考慮，做響應面實驗時，選取乙醇濃度為85%、90%和95% 3個水平。

2.2.3 料液比對黃花菜黃酮提取量的影響

圖3 料液比對黃花菜黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由圖3可知，黃花菜黃酮提取量隨著料液比的增大而增加，并在1∶20時達到了最大值，約為0.55%，當料液比再增大時，黃花菜黃酮提取量反而降低。料液比為1∶15和1∶25時黃花菜黃酮的提取量相當，故在做響應面實驗時，選取料液比為1∶15、1∶20和1∶25 3個水平。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應面分析因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

響應面實驗方案與結果見表2。

表2 響應面實驗方案與結果Table 2 Scheme and results of response surface experiment

建立黃花菜黃酮提取工藝參數(shù)的回歸模型，獲得本實驗評價指標(黃花菜黃酮提取量)的響應值(Y，%)對自變量A(提取時間)、B(乙醇濃度)和C(料液比)的二次多項式回歸方程：黃花菜黃酮提取量(Y，%)=-9.41375+1.0725A+0.17425B+0.056C+2.0E-3AB-0.011AC+3.0E-4BC-0.2A2-1.0E-3B2-1.5E-3C2。

以黃花菜黃酮提取量為評價指標，對該模型進行方差分析，并對模型系數(shù)進行顯著性檢驗，回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型在統(tǒng)計學上呈極顯著(P=0.0001<0.01)，說明實驗模型有統(tǒng)計學意義；且由P值可知,模型中變量A、B、C、AC、A2、B2和C2對黃酮提取量的影響極顯著，說明實驗因素與響應值不是簡單的線性關系，一次項、二次項及A和C的交互作用對響應值均有很大的影響；失擬項的P=0.2451>0.05，不顯著，說明實驗模型擬合度較好，模型選擇合理，模型的殘差可能來源于實驗過程的隨機誤差。模型的校正決定系數(shù)RAdj2=0.9369，說明該實驗中有93.69%的變異分布在方程的因子中，其總變異有6.31%不能由該模型來解釋，R2值為0.9724，說明黃花菜黃酮的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預測索氏提取黃花菜黃酮的實際情況。噪音信號比(Adeq Precision)為13.065>4，說明本模型能真實地反映實驗結果；實驗的精確度(C.V.)為2.39%，說明實驗操作可靠[21]。在所選取的各因素水平范圍內，對響應值的影響順序為：乙醇濃度(B)>料液比(C)>提取時間(A)，且這3個因素均對黃花菜黃酮提取量影響極顯著(P<0.01)。

通過三維響應面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著提取時間、乙醇濃度和料液比的增大或延長，黃花菜黃酮的提取量也隨之增大，但當提取時間、乙醇濃度和料液比增大或延長到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢，提取時間和料液比的交互作用對模型的影響極顯著，其余均不顯著，由圖4中b可知，其橢圓程度和疏密程度與表3回歸模型中的方差分析一致。

圖4 提取時間和料液比對黃花菜黃酮提取量的 響應面圖(a)和等高線圖(b)Fig.4 Response surface diagram (a) and contour diagram (b) of extraction time and solid-liquid ratio on flavonoid extraction amount from Hemerocallis citrina Baroni

2.4 最佳提取條件的確定

由響應面軟件分析可得出索氏提取黃花菜黃酮的最佳工藝為：提取時間2.64 h、乙醇濃度92.5%、料液比1∶18.23(g/mL)，最高提取量為0.57%?？紤]實驗操作的簡便性，修正提取工藝條件為提取時間2.5 h、乙醇濃度90%和料液比1∶20(g/mL)。

2.5 優(yōu)化條件的驗證性實驗

根據(jù)響應面實驗優(yōu)化得出黃花菜黃酮提取的最佳工藝，進行3組平行實驗，驗證響應面實驗結果的可靠性和準確性。驗證性實驗測定黃花菜黃酮提取量見表4。3組平行樣數(shù)據(jù)的RSD為2.11%，滿足要求，得出該提取工藝下黃花菜黃酮提取量較為穩(wěn)定。

表4 驗證性實驗測定黃花菜黃酮提取量Table 4 Verification experiment for determining the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni %

2.6 黃花菜黃酮抗氧化性測定

2.6.1 黃花菜黃酮對DPPH自由基清除能力測定

圖5 黃花菜黃酮和VC對DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni and VC on DPPH free radicals

由圖5可知，在測定濃度范圍內，VC和黃花菜黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增大，與濃度成一定的量效關系。在0.1 mg/mL處，黃花菜黃酮清除率為82.86%，VC的清除率為95.56%。黃花菜黃酮和VC對DPPH清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.021 mg/mL，說明黃花菜黃酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

2.6.2 黃花菜黃酮對ABTS自由基清除能力測定

圖6 黃花菜黃酮和VC對ABTS自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni and VC on ABTS free radicals

由圖6可知，在測定濃度范圍內，黃花菜黃酮對ABTS自由基的清除能力逐漸加強，且與VC的變化趨勢較一致。在0.1 mg/mL時，黃花菜黃酮清除率達到81.92%，VC清除率為94.77%。黃花菜黃酮和VC對ABTS自由基清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.031 mg/mL，說明黃花菜黃酮具有一定清除ABTS自由基的能力。

3 結論

本文采用索氏提取法，通過單因素實驗和響應面實驗優(yōu)化黃花菜黃酮的提取工藝，在提取時間為2.5 h，乙醇濃度為90%，料液比為1∶20(g/mL)時，黃花菜黃酮提取量最大，約為0.55%。由方差分析可知，3個因素及提取時間和料液比的交互項對黃花菜黃酮提取量的影響均極顯著(P<0.01)。通過驗證實驗可得，該工藝下黃花菜黃酮提取量最高，相對標準偏差(RSD)較小，約為2.11%。通過抗氧化性測定可得，黃花菜黃酮和VC對DPPH自由基清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.021 mg/mL；對ABTS自由基清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.031 mg/mL，盡管黃花菜黃酮對DPPH和ABTS自由基的清除率稍弱于VC，但是對其均有一定的清除能力。為今后研究黃花菜黃酮等成分的提取及綜合利用提供了實驗依據(jù)。