孫全敏，馬明昊，遲雪梅，遲乃玉，張慶芳*

(1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物 工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622)

根據(jù)研究，攝入過(guò)量亞硝酸鹽會(huì)降低血液的攜氧能力，引起身體組織缺氧，同時(shí)具有一定的致畸性，可以導(dǎo)致發(fā)育缺陷[1]。亞硝酸鹽也是營(yíng)養(yǎng)物污染的一種普遍形式，通常從各種來(lái)源排放到水生棲息地，包括氮肥、牲畜糞便、大氣沉積物及污水，使水生棲息地中亞硝酸鹽水平升高，降低水生呼吸物種的血液攜氧能力，從而導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)健康受損和大量死亡[2]。在加工肉制品方面，亞硝酸鹽是一種廣泛使用的添加劑，可抑制一些致病微生物和不良微生物(如肉毒梭菌)的生長(zhǎng)，同時(shí)使肉制品呈現(xiàn)典型的粉紅色，并具有獨(dú)特的風(fēng)味。然而，亞硝酸鹽的使用會(huì)導(dǎo)致肉制品中形成致癌物亞硝胺，它還與胃癌、食道癌、鼻咽癌和膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。Zhang等[3]研究了2000—2011年我國(guó)11320個(gè)肉制品樣本中亞硝酸鹽狀態(tài)的變化，85%的樣本含有亞硝酸鹽，每年約有20%的樣本亞硝酸鹽含量高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；結(jié)果還表明，肉制品中殘留的亞硝酸鹽總體上沒(méi)有得到有效控制，在2000—2011年，食品生產(chǎn)和加工過(guò)程中過(guò)量使用亞硝酸鹽的潛在問(wèn)題及其對(duì)健康的影響沒(méi)有改變，這間接表明亞硝酸鹽中毒的可能性和嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。

目前降解亞硝酸鹽的主要方法有物理法、化學(xué)法和微生物降解法等，其中微生物降解法具有更高效、健康、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)[4]。而傳統(tǒng)篩選目的菌株的一般步驟主要為：(1)從自然環(huán)境中采集富含目標(biāo)菌株的樣本；(2)用特定的培養(yǎng)基富集目標(biāo)菌株；(3)分離純化；(4)確定分離菌株的性能；(5)通過(guò)測(cè)序分析確定最有希望的菌株。這個(gè)過(guò)程耗時(shí)，效率低下，而且多僅限于含有目標(biāo)菌株的環(huán)境樣本。同時(shí)，即使得到目標(biāo)菌株，后續(xù)提取DNA進(jìn)行測(cè)序等步驟也繁雜、耗時(shí)，甚至有時(shí)鑒定結(jié)果不是自己想要的菌種。因此，需要一種新的篩選策略來(lái)提高篩選、鑒定的效率。隨著時(shí)代的發(fā)展和科技的進(jìn)步，DNA和RNA測(cè)序技術(shù)徹底改變了基因組學(xué)領(lǐng)域，高通量測(cè)序(HTS)是一項(xiàng)廣泛使用并可獲得的技術(shù)，它允許科學(xué)家以及時(shí)和經(jīng)濟(jì)有效的方式對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組或基因組進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)，HTS技術(shù)已被證明在鑒定和分離一系列以生物技術(shù)為目的的有效菌株方面起著至關(guān)重要的作用[5-7]。

根據(jù)研究，關(guān)于降解亞硝酸鹽的菌株大多數(shù)是乳酸桿菌，如郭志華等[8]從泡菜中篩選出6株，忻曉庭等[9]從發(fā)酵蔬菜中篩選出72株，肖秋穎等[10]從發(fā)酵牦牛乳中篩選出195株?？梢?jiàn)乳酸菌是降解亞硝酸鹽的主要菌群，但貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)[11]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[12]、木糖氧化無(wú)色桿菌(A.xylosoxidansstrain)[13]等菌株對(duì)亞硝酸鹽降解也有良好的效果。同時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌群的篩選，使得其他能降解亞硝酸鹽的菌株得不到充分挖掘和利用。隨著低成本、高通量測(cè)序服務(wù)飛速發(fā)展，其在微生物菌群篩選及多樣性分析中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。本研究通過(guò)使用16S高通量測(cè)序技術(shù)，希望能篩選出一株除乳酸菌之外能高效降解亞硝酸鹽的菌株，以期為發(fā)掘降解亞硝酸鹽菌群資源及其應(yīng)用價(jià)值開(kāi)發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

菌群FXH1：既能降解亞硝酸鹽又能降解硝酸鹽的菌株18個(gè)；

菌群BFXH2：能降解亞硝酸鹽但不能降解硝酸鹽的菌株12個(gè)。

以上菌種暫由本實(shí)驗(yàn)室保藏，菌株理化性質(zhì)(亞硝酸鹽降解率、硝酸鹽還原能力、作用環(huán)境pH值)本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)定完成，數(shù)據(jù)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將FXH1、BFXH2兩個(gè)菌群樣品進(jìn)行16S高通量測(cè)序，測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3 菌株分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)

將目的菌株活化后通過(guò)SDS結(jié)合蛋白酶K法[14]提取樣品基因組DNA，用16S rDNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物交由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序，菌株基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是否和16S高通量測(cè)序結(jié)果一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S高通量測(cè)序

2.1.1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

各樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估[15]結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)拼接、質(zhì)控和嵌合體過(guò)濾后，樣品BFXH2得到62807條序列，有效序列為55257條；樣品FXH1得到61900條序列，有效序列為46800條。

表1 樣品測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of sample sequencing results

2.1.2 基于OTU的Venn圖分析

通過(guò)聚類(lèi)得到的各樣品的OTU個(gè)數(shù)見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品OTU個(gè)數(shù)分布圖Fig.1 OTU number distribution diagram of each sample

由圖1可知，樣品BFXH2的OTU數(shù)為13，樣品FXH1的OTU數(shù)為20。

在97%的相似度水平下，得到了每個(gè)樣品的OTU數(shù)，再利用Venn圖[16]進(jìn)行分析，可進(jìn)一步找出不同樣品中獨(dú)立和共有的菌群數(shù)目。

圖2 OTU-Venn圖Fig.2 OTU-Venn diagram

由圖2可知，兩個(gè)樣品共有OTU數(shù)為9，樣品BFXH2有4個(gè)特有的OTU數(shù)，樣品FXH1有11個(gè)特有的OTU數(shù)。

2.1.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析可反映單個(gè)樣品的物種豐度和物種多樣性，可用于衡量的指標(biāo)有Chao1和Ace(衡量物種豐度)、Shannon和Simpson(衡量物種多樣性)，但后者受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。在相同物種豐度的情況下，群落多樣性與均勻度呈正相關(guān)，當(dāng)Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小時(shí)，表明樣品的物種多樣性越高[17]。在97%的相似度水平下，結(jié)果分析見(jiàn)表2。

表2 Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Alpha diversity index analysis

由表2可知，F(xiàn)XH1的物種豐度大于BFXH2，且物種多樣性更高。

2.1.4 物種分類(lèi)水平分析

2.1.4.1 門(mén)等級(jí)分類(lèi)

圖3 門(mén)等級(jí)物種分布圖Fig.3 Species distribution diagram at phylum level

由圖3可知，在門(mén)等級(jí)上，BFXH2包括3個(gè)門(mén)，其中厚壁菌門(mén)所占相對(duì)豐度為56.4%，變形菌門(mén)占42.6%，放線菌門(mén)占0.9%。FXH1包括3個(gè)門(mén)，其中變形菌門(mén)所占相對(duì)豐度為70.9%，厚壁菌門(mén)占28.1%，放線菌門(mén)占1%。

2.1.4.2 屬等級(jí)分類(lèi)

圖4 屬等級(jí)物種分布Fig.4 Species distribution diagram at genus level

由圖4可知，在屬等級(jí)上，BFXH2包括8個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬所占相對(duì)豐度為56.4%，假單胞菌屬占10.3%，不動(dòng)桿菌屬占9.6%，克雷伯菌屬占4%，泛菌屬占0.06%，谷氨酸桿菌屬占0.9%，其他占0.6%，未分類(lèi)占18.1%。FXH1包括10個(gè)屬，其中乳球菌屬所占相對(duì)豐度為27.9%，假單胞菌屬占26.9%，假交替單胞菌屬占21.9%，泛菌屬占2.0%，不動(dòng)桿菌屬占1.1%，紅球菌屬占1.0%，寡養(yǎng)單胞菌屬占0.6%，克雷伯菌屬占0.4%，其他占0.8%，未分類(lèi)占17.5%。

2.1.5 16S功能基因預(yù)測(cè)分析

2.1.5.1 KEGG功能預(yù)測(cè)分析

圖5 BFXH2與FXH1樣品KEGG功能預(yù)測(cè)對(duì)比圖Fig.5 Comparison of KEGG function prediction of BFXH2 and FXH1 samples

由圖5可知，由KEGG功能預(yù)測(cè)對(duì)比可看出兩個(gè)樣品在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理的豐度方面有較多的顯著性差異。其中樣品FXH1在代謝功能中的外源生物的生物降解和代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、全面和該書(shū)圖譜等和在細(xì)胞過(guò)程功能中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡、運(yùn)輸和分解代謝等以及在遺傳信息處理功能中的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)、翻譯上相對(duì)豐度顯著大于樣品BFXH2；而樣品BFXH2在碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝和在環(huán)境信息處理功能中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)上相對(duì)豐度顯著大于樣品FXH1。

2.1.5.2 COG功能預(yù)測(cè)

由圖6可知，由COG功能預(yù)測(cè)對(duì)比可看出兩個(gè)樣品在細(xì)胞過(guò)程與傳遞、信息存儲(chǔ)與處理和代謝等方面的豐度有較多的顯著性差異。其中樣品FXH1在細(xì)胞過(guò)程與信號(hào)傳遞功能中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性等和在代謝功能中的核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂類(lèi)的運(yùn)輸和代謝等以及在信息存儲(chǔ)與處理功能中的翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生、復(fù)制、重組和修復(fù)、RNA加工和修飾上相對(duì)豐度顯著大于樣品BFXH2；樣品BFXH2在代謝功能中的能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、氨基酸的運(yùn)輸和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝和在信息存儲(chǔ)與處理功能中的轉(zhuǎn)錄以及在細(xì)胞過(guò)程與信號(hào)傳遞功能中的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、防御機(jī)制上相對(duì)豐度顯著大于樣品FXH1。

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)

因樣品BFXH2中芽孢桿菌屬所占豐度較大，且芽孢桿菌屬應(yīng)用前景良好，因此從中選出菌株“8”進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。對(duì)菌株“8”進(jìn)行NCBI的16S rDNA 基因序列比對(duì)分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，結(jié)果顯示與16S高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)。

圖6 BFXH2與FXH1樣品COG功能預(yù)測(cè)對(duì)比圖Fig.6 Comparison of COG function prediction of BFXH2 and FXH1 samples

3 討論與結(jié)論

高通量測(cè)序技術(shù)因測(cè)序數(shù)量龐大、涵蓋面廣、檢測(cè)快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用，如在發(fā)酵食品微生物多樣性的研究[18]、泡菜中常見(jiàn)食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)分析[19]及對(duì)酸漿水中的微生物組成情況分析[20]等方面。而本文通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)能降解亞硝酸鹽的FXH1、BFXH2兩個(gè)樣品進(jìn)行物種豐度、物種多樣性、不同分類(lèi)水平分析，并進(jìn)一步進(jìn)行了功能基因的預(yù)測(cè)。最后根據(jù)微生物組成與結(jié)構(gòu)分析，在屬等級(jí)上，BFXH2中芽孢桿菌屬所占豐度最大，為56.4%，從中挑選編號(hào)為“8”的菌株進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，此菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率為99.7%，作用環(huán)境pH為3.98。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌應(yīng)用廣泛，如可用在醬腌菜中，降低泡菜中亞硝酸鹽和生物胺等有害物質(zhì)[21]，作為淡豆豉炮制過(guò)程中對(duì)黃曲霉毒素的抑制菌[22]，在醬香大曲中作為產(chǎn)醬香菌[23]等方面，同時(shí)Hong等[24]的研究結(jié)果表明可將B.subtilis和B.indicus菌株用作食品補(bǔ)充劑，由此可預(yù)見(jiàn)菌株“8”具有良好的應(yīng)用潛能，特別是在降解亞硝酸鹽方面可發(fā)揮很大的作用。該種篩選策略不僅可以大大提高對(duì)菌種資源的利用，降低篩選成本和時(shí)間，大大提高選菌及鑒定的效率，同時(shí)還可進(jìn)一步了解其應(yīng)用前景，為相應(yīng)菌株的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的借鑒。