苗德升，丁志雯，李甜，李澤信，陳佳雨，錢亮亮，房耀維，劉姝*

(1.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市質(zhì)量技術(shù) 綜合檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006)

幾丁質(zhì)是一種含氮的多糖物，又稱甲殼質(zhì)、甲殼素等，是自然界中含量非常豐富的生物聚合物[1]。幾丁質(zhì)難溶于一般的酸堿，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，這是制約其開發(fā)應(yīng)用的重要原因[2]。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫除乙酰基后的多糖化合物，經(jīng)脫乙?；蟮臍ぞ厶请m然不溶于水、堿溶液和有機(jī)溶劑，但可溶于稀酸溶液，在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛的研究和應(yīng)用[3-4]。

目前，化學(xué)法是工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖的主要方法，該方法以幾丁質(zhì)為原料，通過濃堿處理，得到的產(chǎn)品脫乙酰度不均一，且反應(yīng)過程中易生成有毒物質(zhì)，會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[5]。生物法利用幾丁質(zhì)脫乙酰酶催化幾丁質(zhì)脫乙?；?，對幾丁質(zhì)分子的主鏈不發(fā)生降解，可以制備出脫乙酰度均一的殼聚糖[6]。雖然生物法利用幾丁質(zhì)脫乙酰酶催化幾丁質(zhì)具有安全環(huán)保、產(chǎn)品性質(zhì)較穩(wěn)定等優(yōu)點[7]，但存在幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力較低、催化溫度較高等問題[8]。因此，本研究篩選低溫產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株，為開發(fā)生物酶法工業(yè)制備殼聚糖所用的幾丁質(zhì)脫乙酰酶制劑奠定了試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海底泥樣：采集于高公島海域。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：殼聚糖2.5 g/L，磷酸氫二鉀0.7 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈉0.1 g/L，蒸餾水配制，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：幾丁質(zhì)2 g/L，磷酸氫二鉀0.7 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，對硝基乙酰苯胺0.2 g/L，瓊脂20 g/L，陳海水配制，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，MgSO40.5 g/L，陳海水配制，pH 7.0。

1.3 儀器設(shè)備

SW-CJ-1D 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；JXN-26 高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；分光光度計 杭州明基科學(xué)儀器有限公司；PCR儀 德國Eppendorf有限公司；Nikon 90i全電動顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司；SPX-250B-2 生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.4 低溫產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選

初篩：稱取5 g泥樣置于50 mL富集培養(yǎng)基中，于25 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)3 d。吸取富集樣液用滅菌陳海水稀釋10倍。將稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基中，于25 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)液中，再以3%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)3 d后將發(fā)酵液離心，測定發(fā)酵上清液中幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活。

1.5 幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活力的測定

對硝基乙酰苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精準(zhǔn)稱取0.01 g對硝基乙酰苯胺倒入燒杯中，加入少量蒸餾水，用磁力攪拌器加熱攪拌，使之溶解，冷卻后定容到100 mL容量瓶中，混勻。取6支具塞比色管，用蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋，最終對硝基乙酰苯胺溶液的濃度分別為0，2，4，6，8，10 mg/L。以蒸餾水作參比，測定各管在400 nm處的吸光值(A400)。以對硝基乙酰苯胺濃度為橫坐標(biāo)、400 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

酶活的測定：在離心管中加入25 ℃、pH 7.0的磷酸緩沖液，對硝基乙酰苯胺溶液1 mL，酶液1 mL，25 ℃水浴孵育15 min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，離心后測定上清液的吸光度。以添加1 mL同樣濃度沸水浴滅活15 min的酶液作為對照。

酶活單位(U)定義：將該反應(yīng)體系中每1 h產(chǎn)生1 μg對硝基乙酰苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

1.6 菌株ZCGT05的鑒定

根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定。利用基因組提取試劑盒提取的菌株基因組DNA為模板，利用通用引物進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至基因測序公司進(jìn)行測序，所得的序列上傳至GenBank，通過Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，并用MEGA 11.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7 L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 溫度對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性和穩(wěn)定性的影響

根據(jù)上述酶活測定方法，采用pH 7.0的磷酸緩沖液，在溫度為10，15，20，25，30，35，40 ℃下進(jìn)行酶活測定。將反應(yīng)液在上述溫度下保溫0～10 h，每隔2 h進(jìn)行1次酶活測定，以各個溫度下0 h的酶活為100%，研究其溫度穩(wěn)定性。

1.7.2 pH對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性和穩(wěn)定性的影響

根據(jù)上述酶活測定方法，將溫度保持在25 ℃，在pH為5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9條件下進(jìn)行酶活測定。將反應(yīng)液在上述pH下保溫0～10 h，每隔2 h進(jìn)行1次酶活測定，以各個溫度下0 h的酶活為100%，研究其pH穩(wěn)定性。

1.7.3 金屬離子對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響

根據(jù)上述酶活測定方法，在反應(yīng)體系中加入相同離子濃度的金屬鹽KCl、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、CuSO4、CoCl2、MgSO4、MnSO4，并進(jìn)行酶活測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選

取富集培養(yǎng)后的樣品稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基上，通過變色圈法篩選得到5株產(chǎn)黃色變色圈明顯的菌株，變色圈最大的菌株為ZCGT05，見表1及圖1。

表1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選Table 1 Screening of chitin deacetylase-producing strains

圖1 菌株ZCGT05在篩選平板上的變色圈Fig.1 The discoloration circle of ZCGT05 strain on the screening plate

菌株轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，再以3%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25 ℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)72 h后將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min，測定發(fā)酵上清液中幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活。菌株ZCGT05酶活最高，達(dá)到10.18 U/mL。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株ZCGT05的形態(tài)學(xué)特征

由圖1可知，菌株ZCGT05在2216E培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 d，菌落呈圓形，淡黃色，半透明，表面濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央突起，直徑在0.5～0.8 cm，易挑取。

2.2.2 菌株ZCGT05的生理生化特征

菌株ZCGT05的生理生化試驗結(jié)果見表2。

表2 菌株ZCGT05的生理生化試驗結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test results of ZCGT05 strain

由表2可知，明膠液化試驗、H2O2試驗、檸檬酸鹽試驗均呈陽性，吲哚試驗、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、果糖、反硝化試驗均為陰性。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合生理生化結(jié)果，初步將菌株ZCGT05鑒定為Lysinibacillusmacroides。

2.2.3 菌株ZCGT05的16S rDNA擴(kuò)增及分析

將PCR產(chǎn)物送至南京思普金公司測序，所得序列提交GenBank(登錄號：MK263030)。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與菌株Lysinibacillusmacroides(登錄號：NR114920.1)16S rDNA相似性最高，達(dá)到99%。用MEGA 11.0軟件進(jìn)行16S rDNA序列的比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株ZCGT05與Lysinibacillusmacroides親緣關(guān)系最近，見圖2。目前，尚未見延長賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的報道。

圖2 基于16S rDNA序列菌株L. macroides ZCGT05的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of L. macroides ZCGT05 based on 16S rDNA sequence

2.3 L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 溫度對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響

以對硝基乙酰苯胺濃度為橫坐標(biāo)、400 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。線性方程為：y=0.0586x+0.0038，R2為0.9992，吻合度較高。

圖3 對硝基乙酰苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of p-nitroacetanilide

圖4 溫度對L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由圖4可知，隨著溫度的升高，相對酶活先上升后下降，當(dāng)溫度為25 ℃時酶活最高，故該酶的最適溫度為25 ℃。目前，幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最適催化溫度為30～60 ℃，多數(shù)催化溫度為50～60 ℃，低溫幾丁質(zhì)脫乙酰酶鮮有報道。秦汪艷等[10]報道了菌株P(guān)eniciliumjanthinellum幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最適溫度為30 ℃；菌株ColletotrichumgloeosporioidesCF-6幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最適溫度為28 ℃[11]。菌株L.macroidesZCGT05產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最適溫度為25 ℃，在工業(yè)應(yīng)用中可節(jié)省用于加熱提高反應(yīng)溫度的能耗。

2.3.2 溫度對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響

圖5 溫度對L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì) 脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

通過測定菌株L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶在不同溫度(15～30 ℃)下水浴不同時間后的相對酶活來研究酶的熱穩(wěn)定性。由圖5可知，25 ℃水浴10 h后相對酶活仍達(dá)到80%，30 ℃水浴10 h后相對酶活僅為26%。

2.3.3 pH對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響

圖6 pH對L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì) 脫乙酰酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由圖6可知，隨著pH增大，相對酶活先上升后下降，當(dāng) pH為7.0時酶活最高，該酶的最適pH為7.0。目前報道的幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最適pH為3.5～12.0，多數(shù)為偏酸性。只有菌株Aspergillusflavus和菌株Micromonosporaaurantiaca幾丁質(zhì)脫乙酰酶最適pH為7.0[12-13]。

2.3.4 pH對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響

圖7 pH對L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì) 脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

將菌株L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶在不同pH(6.5～8.5)下孵育不同時間后測定其相對酶活，結(jié)果表明，孵育時間越長相對酶活越低。由圖7可知，不同pH條件下的相對酶活在孵育2 h內(nèi)均能達(dá)到80%以上，但孵育10 h后，pH為6.5和8.5條件下的相對酶活較低，pH 7.5條件下的相對酶活在孵育10 h后仍可達(dá)到81%。

2.3.5 金屬離子對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響

金屬離子對L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響見圖8。

圖8 金屬離子對L. macroides ZCGT05幾丁質(zhì) 脫乙酰酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由圖8可知，Co2+、Mg2+、Mn2+對酶活有促進(jìn)作用，Zn2+、Ca2+對酶活的促進(jìn)作用相對較低，而K+、Fe2+、Cu2+對酶活具有抑制作用。不同來源的幾丁質(zhì)脫乙酰酶受金屬離子對其酶活的影響各有不同，如Mn2+對Bacillusamyloliquefaciens Z7幾丁質(zhì)脫乙酰酶有強(qiáng)烈抑制作用， Fe2+對Bacillusamyloliquefaciens Z7的酶活具有一定促進(jìn)作用[14-15]。

3 結(jié)論

本研究從連云港市海州灣海域海泥樣品中篩選獲得了一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶細(xì)菌菌株ZCGT05，通過菌落形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為Lysinibacillusmacroides。L.macroidesZCGT05幾丁質(zhì)脫乙酰酶最適溫度和pH分別為25 ℃和7.0，在20～25 ℃保溫2 h，殘留酶活高于85%；在pH 7.0～8.0孵育2 h，殘留酶活高于90%。Co2+、Mg2+、Mn2+對酶活有顯著激活作用，而Cu2+對酶活有顯著抑制作用。