賈世艷，仲啟明，司瑞花，范曉陽(yáng)，嚴(yán)文允，劉光珍

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012)

膜性腎病(Membranous nephropathy,MN)是成人腎病綜合征的主要病因之一，僅次于發(fā)病率最高的IgA腎病，目前已成為我國(guó)腎病的主要類型[1-2]。MN臨床常表現(xiàn)為腎病綜合征，以大量蛋白尿并伴有低蛋白血癥為主要表現(xiàn)，如不及時(shí)治療，還有向終末期腎功能衰竭和尿毒癥轉(zhuǎn)歸的危險(xiǎn)[3-5]。目前MN主要以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為治療手段，但是療效較差，復(fù)發(fā)率高，極易引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[6]。

近年來(lái)，中藥復(fù)方治療MN效果顯著，安全性高，不良反應(yīng)少，愈來(lái)愈受到臨床的重視[7-8]。復(fù)方蛇龍膠囊是劉光珍教授總結(jié)多年治療慢性腎臟疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)，在“清熱利濕，活血化瘀”組方理論基礎(chǔ)上形成的，臨床療效確切，能明顯改善MN大鼠蛋白尿等相關(guān)指標(biāo)，保護(hù)腎小球的功能與結(jié)構(gòu)[9-11]。為進(jìn)一步揭示復(fù)方蛇龍膠囊作用機(jī)制，本研究通過(guò)構(gòu)建陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin,C-BSA)誘導(dǎo)膜性腎病大鼠模型，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)復(fù)方蛇龍膠囊治療MN的潛在分子機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性揭示，不僅對(duì)復(fù)方蛇龍膠囊的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)能夠加深對(duì)MN發(fā)病機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重160～180 g，6周齡，共40只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(京)2017-0005，實(shí)驗(yàn)方案符合山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物倫理要求。

1.1.2 藥物與制備：復(fù)方蛇龍膠囊由穿山龍(批號(hào)20191101)、鬼箭羽(批號(hào)20190901)和白花蛇舌草(批號(hào)20190801)組成，均購(gòu)自山西省中醫(yī)院藥房。將上述3味中藥加10倍水煎煮2次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.23～1.28(80 ℃)的清膏，真空干燥，粉碎成粗粉，備用。

1.1.3 主要試劑與儀器：C-BSA(批號(hào)102062773)；一水乙二胺(批號(hào)6780-13-8)；弗氏不完全佐劑(批號(hào)344291)；Forma -80 ℃冰箱(美國(guó)Thermo Scientific)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模制備、動(dòng)物分組及給藥：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行24 h尿蛋白定量，剔除大于5 mg的蛋白尿陽(yáng)性大鼠，模型制備參照改良Border法[12]，預(yù)免疫階段，取C-BSA 1 mg溶解于0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液中，與等量弗氏不完全佐劑在注射器中來(lái)回推動(dòng)充分乳化成乳白色的懸濁液后，大鼠頸背部、腹股溝和腋下等多點(diǎn)皮下注射0.1 ml，隔日1次，共3次；正式免疫階段，將C-BSA與等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，大鼠尾靜脈注射，注射劑量16 mg/kg，每周3次，連續(xù)4周。將造模大鼠隨機(jī)分為模型組和復(fù)方蛇龍膠囊高、中、低劑量組，每組10只，模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，給藥劑量根據(jù)人與大鼠的體表面積換算成等效給藥劑量[13]；復(fù)方蛇龍膠囊高、中、低劑量組分別給予1.5、0.75、0.375 g/kg復(fù)方蛇龍膠囊，每天1次，連續(xù)8周。

1.2.2 腎組織樣本采集：末次給藥24 h后，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)程麻醉大鼠，快速完整采集各組大鼠腎臟組織，濾紙吸去多余水分，組織采用液氮速凍后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析：腎組織高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序采用華大基因公司(深圳)BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)完成。采用Qiagen RNeasy Micro kit試劑盒提取腎組織總RNA，Nano Drop和Agilent 2100生物分析儀對(duì)提取的總RNA進(jìn)行合格定量，構(gòu)建mRNA文庫(kù)。測(cè)序完成后，采用SOAPnuke對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，HISAT將clean reads與GCF_000001895.5_Rnor_6.0大鼠基因組進(jìn)行比對(duì)和注釋，Bowtie 2對(duì)參考編碼基因進(jìn)行校正，RSEM計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平。

1.2.4 差異表達(dá)基因分析：使用PossionDis算法進(jìn)行差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：log2基因表達(dá)差異倍數(shù)(Fold change,FC)絕對(duì)值≥2.00，F(xiàn)DR≤0.001，對(duì)DEGs進(jìn)行后續(xù)的基因本體論功能(Gene Ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)生物通路富集分析。

1.2.5 GO功能和KEGG富集分析：使用Blastx對(duì)Unigene進(jìn)行KEGG注釋，Blast2 GO以及NR注釋結(jié)果進(jìn)行GO注釋，GO和KEGG富集分析采用R語(yǔ)言中phyper函數(shù)，Q值≤0.05認(rèn)為在候選基因中顯著富集。

1.2.6 建立復(fù)方蛇龍膠囊治療MN機(jī)制中蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI)和篩選關(guān)鍵基因：將DEGs上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置相互作用可信區(qū)間為中度(Medium confidence 0.400)，繪制差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖，把STRING數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，利用Cytoscape-hubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的前10個(gè)基因。

2 結(jié) 果

2.1 確定DEGs篩選結(jié)果 當(dāng)|log2FC|≥2.00，F(xiàn)DR≤0.001時(shí)，與模型組相比，復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組腎組織中顯著表達(dá)DEGs共1353個(gè)，其中上調(diào)基因1039個(gè)，下調(diào)基因314個(gè)；復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組腎組織中顯著表達(dá)DEGs共1410個(gè)，其中上調(diào)基因1089個(gè)，下調(diào)基因321個(gè)；復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組腎組織中顯著表達(dá)DEGs共1575個(gè)，其中上調(diào)基因833個(gè)，下調(diào)基因742個(gè)。將上述3組數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉比對(duì)，得到685個(gè)共表達(dá)顯著差異基因，其中535個(gè)上調(diào)基因，150個(gè)下調(diào)基因。見圖1。

圖1 不同劑量組篩選出的差異表達(dá)基因韋恩圖分析

2.2 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析 GO功能主要分為細(xì)胞組分(Cellular component,CC)、生物過(guò)程(Biological process,BP)和分子功能(Molecular function,MF)三大類別。對(duì)535個(gè)共表達(dá)上調(diào)基因和150個(gè)共表達(dá)下調(diào)基因分別進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析顯示，顯著上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞粘附、正向調(diào)控細(xì)胞遷移和鈣離子結(jié)合等生物過(guò)程；顯著下調(diào)基因主要富集在細(xì)胞膜組分，參與調(diào)控跨膜運(yùn)輸過(guò)程和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。KEGG富集分析結(jié)果顯示，顯著差異表達(dá)基因主要富集在PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，按Q值≤0.05視為顯著富集，展示前5個(gè)條目。見表1、2。

表1 上調(diào)差異基因的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集

表2 下調(diào)差異基因的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)685個(gè)共表達(dá)顯著差異基因的蛋白質(zhì)相互作用，構(gòu)建了一個(gè)由501個(gè)節(jié)點(diǎn)和1283條邊組成的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(刪除網(wǎng)絡(luò)中不連接的基因)。利用Cytoscape軟件對(duì)PPI進(jìn)行可視化分析，應(yīng)用Cytoscape-hubba插件篩選出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，由多種模式算法結(jié)果；按連接度(Degree)模式篩選出前10個(gè)關(guān)鍵基因，分別是Egfr、Fn1、Rac3、Frk、Cdh1、Agt、Hspg2、Itga8、Akt3和Fgfr2。見表3(圖2)。

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因連通度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Degree模式下前10個(gè)基因連通度

2.4 關(guān)鍵基因生物學(xué)功能分析 GO功能富集分析顯示關(guān)鍵基因主要富集在細(xì)胞膜表面及間質(zhì)，參與跨胞外基質(zhì)組織及黏附過(guò)程，調(diào)控激酶活性；KEGG富集分析結(jié)果顯示關(guān)鍵基因主要富集在PI3K/Akt信號(hào)通路，按Q值≤0.05視為顯著富集，展示前5個(gè)條目。見表4。

3 討 論

近年來(lái)，MN的患病率逐年上升，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，盡管對(duì)癥治療能夠緩解部分臨床癥狀，但約30%的患者進(jìn)展到終末期腎臟疾病，最終依賴腎透析，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因此尋求更加安全有效的治療藥物來(lái)延緩疾病進(jìn)展、改善預(yù)后成為亟需解決的難點(diǎn)[14]。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)及通路眾多，有必要從整體上闡釋中藥復(fù)方的作用機(jī)制，提升中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，探討復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)MN大鼠腎組織中DEGs表達(dá)的影響，結(jié)合生物信息學(xué)分析，旨在為復(fù)方蛇龍膠囊治療MN的深入研究提供思路。

Itga8屬于整合素家族，主要表達(dá)于腎系膜細(xì)胞，為腎毛細(xì)血管內(nèi)皮提供機(jī)械穩(wěn)定和功能支持，可調(diào)控細(xì)胞基質(zhì)黏附、凋亡和自噬等生物學(xué)過(guò)程，是維持腎小球穩(wěn)態(tài)的重要分子，表達(dá)水平可作為腎小球疾病預(yù)后的危險(xiǎn)分層標(biāo)志物[15]。目前，研究證實(shí)腎足細(xì)胞損傷是參與各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病等腎病綜合征進(jìn)展的關(guān)鍵因素，足細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷是不可逆的，是促進(jìn)MN惡性生物學(xué)進(jìn)展的重要因素[16-17]。研究表明，足細(xì)胞可表現(xiàn)出較高的基礎(chǔ)自噬活性，對(duì)維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能以及代謝穩(wěn)態(tài)有重要的調(diào)控作用，足細(xì)胞自噬調(diào)控異常是足細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[18]。Rac3屬于Rac蛋白家族，對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡和自噬等行為具有重要的調(diào)控功能，細(xì)胞自噬和凋亡是細(xì)胞程序性死亡的重要機(jī)制，自噬-凋亡動(dòng)態(tài)平衡對(duì)MN的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。研究表明Rac3表達(dá)水平升高能夠通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡和自噬[19]。成熟的足細(xì)胞是終末分化的上皮細(xì)胞，無(wú)法通過(guò)細(xì)胞增殖來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞數(shù)量，因此復(fù)方蛇龍膠囊可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕MN大鼠足細(xì)胞損傷。Agt是合成所有血管緊張素多肽所必需的底物，循環(huán)中的Agt不能通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)屏障，而尿Agt主要來(lái)源于腎臟，因此尿Agt水平能夠反映腎臟纖維化的情況，可能作為腎臟損傷尤其是慢性腎損傷程度的指標(biāo)[20]，因此推測(cè)復(fù)方蛇龍膠囊通過(guò)降低腎臟中Agt表達(dá)水平，進(jìn)而減輕腎損害。

針對(duì)關(guān)鍵基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，復(fù)方蛇龍膠囊治療MN主要通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，從而影響足細(xì)胞細(xì)胞增殖、自噬和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。Akt是PI3K的直接靶基因，處于信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，外界因素通過(guò)激活PI3K而使Akt磷酸化。研究表明，激活PI3K/Akt信號(hào)通路能夠上調(diào)足細(xì)胞自噬作用，抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎小球足細(xì)胞并改善蛋白尿[21]。

表4 前10個(gè)關(guān)鍵基因的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方蛇龍膠囊組Egfr、Fgfr2、Akt3表達(dá)水平明顯上升，提示復(fù)方蛇龍膠囊可能通過(guò)細(xì)胞表面受體Egfr和Fgfr2激活Ras蛋白，導(dǎo)致磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路，提高足細(xì)胞自噬水平，加速對(duì)受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)的清除，促進(jìn)足細(xì)胞修復(fù)，從而保護(hù)足細(xì)胞。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方蛇龍膠囊可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)控Akt3等關(guān)鍵基因表達(dá)，誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬水平升高，抑制足細(xì)胞損傷，為復(fù)方蛇龍膠囊治療MN提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究得出的結(jié)論未通過(guò)相關(guān)基礎(chǔ)研究予以驗(yàn)證，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。