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        姜黃素對阿霉素腎病大鼠Notch信號通路相關(guān)蛋白的影響

        2022-07-13 05:44:22曹慧慧王悅彤趙仁偉席少卿李曉琪王漱非
        陜西中醫(yī) 2022年7期
        關(guān)鍵詞:阿霉素姜黃腎小球

        曹慧慧,王悅彤,屈 凱,趙仁偉,席少卿,李曉琪,沈 霞,王漱非

        (1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;2.西安市長安區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710100;3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710003)

        慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)是指各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙[1]。目前CKD的治療主要有透析和腎移植,不僅腎源有限[2],而且費用昂貴,故延緩CKD進展尤為重要[3]。腎小球硬化是慢性腎臟病進展的主要病理因素,腎小球的主要生理結(jié)構(gòu)有腎小球系膜細胞和系膜基質(zhì)[4],腎小球基底膜增厚和細胞外基質(zhì)的過度沉積是腎小球硬化的主要病理變化,因此抑制腎小球基底膜增厚和細胞外基質(zhì)的過度沉積可延緩腎小球硬化進展。姜黃素為中藥姜黃的根莖提取的多酚類單體,具有抗炎、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、降脂和降糖[7]等藥理作用,且不良反應(yīng)小。有研究表明姜黃素可減輕糖尿病腎病小鼠的腎損傷和腎纖維化[8-9]、改善腎小球細胞外基質(zhì)的過度沉積[10]。進一步研究表明,姜黃素對血管疾病、神經(jīng)根疼痛[5]、腎臟病[3]、視網(wǎng)膜病變和胰腺疾病[11]均具有一定的療效。近年來,多項研究表明Notch信號通路不僅在腎臟的發(fā)育中扮演重要角色,而且參與多種腎臟疾病的發(fā)生[12-13]。本實驗擬建立阿霉素腎病大鼠模型,觀察姜黃素通過調(diào)控Notch信號通路下神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1(Neurogenic locus notch homolog protein 1,Notch1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)、單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的蛋白表達延緩阿霉素大鼠腎小球硬化的進程,并初步探討其作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 實驗動物:健康清潔級雄性SD大鼠60只,2~3月齡,體重(200±20)g,購于四川省成都市達碩實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(川)2015-030。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,實驗室溫度20~25 ℃,濕度55%~65%,大鼠均按標準要求給予顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水和自然晝夜節(jié)律光照。實驗室的管理與操作符合相關(guān)法律及倫理規(guī)定。

        1.1.2 實驗藥物與試劑:鹽酸貝那普利片(國藥準字H20030514);注射用鹽酸阿霉素(國藥準字C4125316-40-9);檸檬酸抗原修復(fù)液(批號G1202)、3%過氧化物酶封閉液(批號G0115)、蘇木素染液(批號G1004)、HRP標記山羊抗兔(批號G23303)均購自武漢Servicebio公司;Plus RNA提取試劑盒購自日本TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司;Platinum SYBR Green qPCR SuperMk-UDG試劑盒購自美國Invitrogen公司;引物購自美國國立生物技術(shù)信息中心;Notch1、TGF-β1、MCP-1均購自英國Abcam公司;ECL辣根過氧化物酶發(fā)光液購自北京普利萊公司;DEPC試劑、不同梯度乙醇、PBS緩沖液等由陜西省中醫(yī)醫(yī)院病理實驗室提供。

        1.1.3 實驗儀器:AL104電子天平(上海梅特勒)、低溫高速離心機(美國Beckman公司)、-20 ℃冰箱(青島海爾)、-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)、AU2700全自動生化分析儀(日本Olympus公司)、LX20生化分析儀(美國Beckman公司)、ABI 9700PCR擴增儀(美國Thermo公司)、Nano-200超微量核酸分析儀(美國GE公司)、羅氏480熒光定量PCR儀(德國Roche公司)、顯微鏡(日本Olympus公司)、H-600電子顯微鏡(日本日立公司)等。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 動物分組:將60只SD雄性大鼠按體重大小從1到60編號,從隨機數(shù)字表中的任一行任一列開始依次讀取2位數(shù)作為一個隨機數(shù)錄于編號下,然后將60個隨機數(shù)從小到大編序號,將序號記錄在對應(yīng)的每個隨機數(shù)下面;規(guī)定序號1~10為空白組、序號11~20為模型組、序號21~30為對照組、序號31~40為姜黃素低劑量組、序號41~50為姜黃素中劑量組、序號51~60為姜黃素高劑量組。

        1.2.2 造模及給藥:適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后,除空白組外其余各組分別于第1、7天給予鹽酸阿霉素4 mg/kg尾靜脈注射,建立阿霉素腎病大鼠模型,14 d后檢測24 h尿蛋白≥150 mg,說明造模成功。造模成功后對照組以10 mg/kg鹽酸貝那普利灌胃;姜黃素低、中、高劑量組分別予50、100、200 mg/kg姜黃素灌胃;空白組和模型組分別予等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃,各組均持續(xù)灌胃6周。

        1.2.3 24 h尿蛋白定量及血生化指標檢測:于灌胃6周末收集各組大鼠24 h尿液,以3500 r/min離心10 min,尿液分析儀檢測尿蛋白含量。采用Beckman LX20生化分析儀自動分析血清尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(Serum creatinine,Scr)水平。

        1.2.4 電鏡觀察腎臟組織病理改變:用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,摘除其右側(cè)腎臟,將腎臟包膜及周圍組織分離去除,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定,分別以70%、80%、95%、無水乙醇梯度脫水,二甲苯透明,60 ℃浸蠟60 min,迅速包埋,切成5~6 μm的薄片,用抗熒光淬滅封片液封片,電鏡下觀察腎臟組織病理改變,以上過程均在無菌條件下進行。

        1.2.5 RT-PCR法檢測腎組織Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達:于-80 ℃凍存管中取2.5 mm×2.5 mm×2.5 mm腎臟組織,經(jīng)研磨、勻漿提取RNA,紫外分光光度計測定樣品中RNA總量。用PCR擴增儀反轉(zhuǎn)錄制備cDNA,核酸分析儀分析cDNA濃度,確保純度良好。引物由美國國立生物技術(shù)信息中心提供,Notch1:上游引物5’-AGAGCAGCCTACATTGAGACCT-3’,下游引物5’-CCACATTCCAGCACACTCAAGGCA-3’,長度101 bp;TGF-β1:上游引物5’-ACTACGCCAAAGAAGTCACC-3’,下游引物5’-CACTGCTTCCCGAATGTCT-3’,長度125 bp;MCP-1:上游引物5’-AAACCAGCCAACTCTCACT-3’,下游引物5’-GTAGTTCTCCAGCCGACTC-3’,長度200 bp。退火溫度60 ℃,30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物上樣經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠核酸電泳后,用BIO-RAD計算機凝膠成像分析系統(tǒng)、Quantity-one軟件進行半定量分析。

        1.2.6 免疫組化法檢測腎組織Notch1、TGF-β1、MCP-1蛋白表達:石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,3%過氧化氫滅活封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液后,置于微波爐進行微波熱修復(fù),以暴露抗原決定簇。3%過氧化物酶封閉液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,滴加3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30 min;滴加一抗,37 ℃ 2 h,4 ℃過夜,37 ℃復(fù)溫45 min;二抗孵育37 ℃ 30 min;滴加DAB顯色液,鏡下控制反應(yīng)時間;蘇木素復(fù)染,70%~100%酒精梯度脫水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明2 min,中性樹膠封片。顯微鏡采集圖像,并采用圖像分析系統(tǒng)進行分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前,各組大鼠毛發(fā)整齊光滑,活動正常,反應(yīng)靈敏。造模2~3 d后,造模大鼠開始出現(xiàn)毛發(fā)凌亂、活動減少,5~6 d后部分大鼠出現(xiàn)便溏、反應(yīng)遲鈍、精神不振,模型組癥狀明顯。對照組和姜黃素低、中、高劑量組大鼠精神狀態(tài)有所改善,其中姜黃素高劑量組癥狀改善程度最明顯。

        2.2 各組大鼠腎功能指標比較 見表1。與空白組比較,模型組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,對照組、姜黃素各劑量組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr水平顯著降低(P<0.05);與對照組比較,姜黃素中、高劑量組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr水平顯著降低(P<0.05),姜黃素低劑量組血肌酐水平顯著降低(P<0.05)。

        表1 各組大鼠腎功能指標比較

        2.3 各組大鼠腎臟組織病理結(jié)構(gòu)比較 空白組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常,模型組大鼠腎小球中央出現(xiàn)玻璃樣小體,周圍部分纖維化,腎小管萎縮,間質(zhì)內(nèi)小動脈管腔變窄,系膜外基質(zhì)呈輕、中度增生,淋巴細胞、漿細胞浸潤,可見蛋白管型,足細胞損傷較重;姜黃素各劑量組及對照組上述病理改變減輕,其中姜黃素高劑量組減輕最明顯(圖1)。

        表1 各組大鼠腎功能指標比較

        A:空白組;B:模型組;C:對照組;D:姜黃素低劑量組;E:姜黃素中劑量組;F:姜黃素高劑量組

        2.4 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達比較 見表2。與空白組比較,模型組、對照組、姜黃素各劑量組大鼠腎臟組織Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達均升高(P<0.05);與模型組比較,對照組、姜黃素各劑量組大鼠腎臟組織Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達降低(P<0.05),其中姜黃素高劑量組表達最低(P<0.05);與對照組比較,姜黃素高劑量組大鼠腎臟組織Notch1、MCP-1 mRNA表達降低,姜黃素中、低劑量組TGF-β1 mRNA表達降低(P<0.05)。

        表2 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達比較

        2.5 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1蛋白表達比較 見表3(圖2~4)。正常情況下,Notch1、TGF-β1、MCP-1在腎組織少量表達??瞻捉MNotch1、TGF-β1、MCP-1僅微量表達,幾乎不可見,著色極淡;模型組Notch1、TGF-β1、MCP-1呈強陽性表達,表現(xiàn)為黃棕色或淡黃色,著色較重;對照組、姜黃素各劑量組Notch1、TGF-β1、MCP-1表達量介于空白組和模型組之間,姜黃素各劑量組均能有效下調(diào)Notch1、TGF-β1、MCP-1表達,其中以姜黃素高劑量組最明顯。提示姜黃素可能通過降低Notch 1、TGF-β1、MCP-1表達量起到延緩腎小球硬化的作用。

        表3 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1蛋白表達比較

        3 討 論

        腎小球硬化是CKD進展至慢性腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)。有效延緩腎小球硬化,并探討其發(fā)病機制是目前臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的重要問題之一。腎小球硬化的病因較多,西醫(yī)病理學(xué)認為腎小球硬化是由腎小球基底膜增厚、系膜細胞增殖、足細胞融合等導(dǎo)致,由多種細胞因子和生物活性物質(zhì)參與,致使腎小球基底膜增厚和細胞外基質(zhì)過度積聚,最終導(dǎo)致腎小球硬化[14]。

        相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1、MCP-1、Notch1參與了腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展過程。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的成員,參與多種器官纖維化的過程,是目前公認的誘導(dǎo)纖維化能力最強的生長因子[15],是腎纖維化的主要驅(qū)動因子。MCP-1是一種對單核細胞具有趨化和激活活性的細胞因子,已證實MCP-1與多種腎臟疾病關(guān)系密切,在感染、缺血、損傷等條件下,腎臟系膜細胞大量分泌釋放MCP-1,使炎癥細胞活化和積聚,加重腎臟損傷[16]。Notch1是Notch信號通路的同源受體,在維持腎小管上皮細胞功能中發(fā)揮重要作用[17]。有研究表明Notch信號通路能調(diào)節(jié)足細胞分化,特定條件下激活Notch1損傷足細胞損傷[18],而足細胞損傷是腎小球硬化的主要病理過程之一。

        腎虛日久,致瘀血阻腎絡(luò)是腎小球硬化的主要病機[4]。中醫(yī)藥可有效延緩腎小球硬化的進程。本課題組前期初步證實,益腎散結(jié)復(fù)方及拆方可有效改善腎功能,防治腎小球硬化[19],但復(fù)方由多種藥物配伍而成,拆方亦由數(shù)味功效相似的藥物組成,其配伍機制有待進一步研究。因此,課題組進一步開展復(fù)方中單味中藥的研究。姜黃素為益腎散結(jié)復(fù)方藥物姜黃的提取物,實驗通過建立阿霉素大鼠腎病模型,低、中、高劑量姜黃素灌胃治療后,發(fā)現(xiàn)其可減少大鼠24 h尿蛋白定量,降低BUN、Scr水平。同時,腎臟病理結(jié)構(gòu)方面,接受姜黃素治療后的大鼠腎臟腎小球系膜外基質(zhì)增生和足細胞損傷程度明顯改善,這與課題組前期研究益腎散結(jié)復(fù)方及拆方可改善阿霉素大鼠腎功能、控制蛋白尿的結(jié)論相一致[20]。Notch1、TGF-β1、MCP-1在阿霉素大鼠腎臟組織高表達,說明其參與腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展,姜黃素灌胃后,其表達量顯著下降,說明姜黃素可下調(diào)其表達以抑制腎小球硬化的進程,且高劑量姜黃素對腎小球硬化的臨床療效優(yōu)于鹽酸貝那普利組。

        綜上所述,姜黃素可通過下調(diào)Notch1、TGF-β1、MCP-1在腎臟組織的表達抑制腎小球基底膜增厚和細胞外基質(zhì)過度沉積,進而延緩腎小球硬化進程。

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