楊新平，謝玉清，周留艷，代金平，王小武， 張慧濤，王志方，馮 蕾

(新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】漆酶廣泛存在于自然界中，如植物、真菌、細菌、動物及昆蟲中[1]。漆酶屬于藍色氧化酶家族，是一種含銅的多酚氧化酶，是重要的木質纖維降解酶之一，還能催化降解多種芳香族化合物,特別是酚類[2]。真菌漆酶作為具有重要生物學功能及應用價值的氧化還原酶，已成為農業(yè)環(huán)境、植物保護、微生物學、生物化工等領域的研究熱點。無柄靈芝菌(G.resinaceum)屬擔子菌綱的多孔菌目，是漆酶最主要的生產者之一。真菌漆酶的生產模式包括固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，工業(yè)生產基本以液體發(fā)酵為主，而高產酶發(fā)酵工藝的優(yōu)化及漆酶穩(wěn)定性的研究是工業(yè)化生產漆酶的關鍵[3]。漆酶是一種分布廣泛的多酚氧化酶，在農業(yè)、食品、能源和環(huán)保等領域具有重要的應用價值。無柄靈芝菌可以合成分泌包括漆酶在內的多種木質纖維素降解酶，這些酶的活性會隨著發(fā)酵工藝的不同而不同，所以對產酶發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，對于提高漆酶產量和酶活具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】真菌漆酶在真菌色素合成、病原菌致病性、形態(tài)建成及防御反應等多種生物學過程中發(fā)揮作用[4]。漆酶的作用底物廣泛，能夠催化木質素、酚類、胺類等芳香族、非芳香族化合物的氧化分解，將分子氧還原成水，被廣泛應用于農業(yè)廢棄物資源化利用，環(huán)保、造紙、紡織、食品加工、藥品改良等領域[5]。真菌漆酶比細菌漆酶、植物漆酶等具有更好的熱穩(wěn)定性、金屬離子耐受性及更高的底物催化氧化性[6]。【本研究切入點】無柄靈芝菌(G.resinaceum)漆酶的合成和分泌受到營養(yǎng)水平、培養(yǎng)條件、生長階段以及培養(yǎng)基中誘導劑的嚴格調控，木質素或木質素相關的芳香類化合物、N源和C源也能調節(jié)漆酶的合成；漆酶活性對不同種類、不同濃度的金屬離子以及誘導劑的響應不盡相同，其具有較復雜的生理功能及調控機制。無柄靈芝菌(G.resinaceum)漆酶對不同種類、不同濃度的金屬離子以及誘導劑的響應不盡相同，其具有較復雜的生理功能及調控機制，需闡明漆酶作用機制提供基礎?！緮M解決的關鍵問題】對分離篩選到的無柄靈芝菌產漆酶的發(fā)酵條件及部分酶學性質進行研究，為真菌漆酶的規(guī)?；a奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02由采自新疆天山的菌種中分離篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

產酶基礎培養(yǎng)基MF[7]：麥麩25 g，葡萄糖10 g，酒石酸銨1.84 g，NaCl 1.0 g、KH2PO42 g，琥珀酸鈉1.18 g， VB110 mg，聚山梨酯-80 0.5 g，微量元素溶液70 mL，加水定容至 1 000 mL，pH調至5.5。

微量元素組成[8]：MgSO4·7H2O 3.0 g，MnSO4·H2O 0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KAl(SO4)2·12H2O 10 mg，H3BO310 mg，NaMnO4·2H2O 10 mg，加水定容至1 000 mL。

1.1.3 酶檢測試劑

0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0)，0.5 mmol/L 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，漆酶(laccase)[9]。

1.2 方 法

1.2.1 漆酶活力測定

采用ABTS[2，2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]法[10-11]。反應體系組成為: 0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0)1.95 mL、0.5 mmol/L 連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)2.00 mL和適當稀釋的酶液50 μL， 相應反應溫度下啟動反應。并在3 min內連續(xù)測定反應液420 nm(ε=3.6×104mol/L/cm)處吸光值的增加值。該條件下，1 min使1 μmol/L的ABTS氧化所需的酶量定義為1個活力單位(U)。

漆酶活力計算公式：漆酶活力(U/L)=(n×△A×106×V1)/(3.6×104×3×V2).

其中：n為酶液稀釋倍數(shù)；V1為反應總體積；V2為反應酶液體積；△A為3 min內反應液在420 nm處吸光度的變化值；3.6×104為ABTS氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)(mol/L/cm)。

1.2.2 產漆酶發(fā)酵條件

1.2.2.1 碳源對發(fā)酵產漆酶的影響

采用單因素試驗設計[12]，在基礎培養(yǎng)基MF的基礎上進行碳源替換，分別以0.5%的麥芽糖、蔗糖、甘油、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、淀粉、麥麩作為碳源，裝液量50 mL/瓶，種子菌齡為5 d，接種量5%，pH調至5.5，發(fā)酵7 d后檢測漆酶活性。

1.2.2.2 氮源對發(fā)酵產漆酶的影響

采用單因素試驗設計，在基礎培養(yǎng)基MF的基礎上進行氮源替換，分別以0.5%的干酪素、酵母粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、酒石酸銨作為氮源，裝液量50 mL/瓶，種子菌齡為5 d，接種量5%，pH調至5.5，發(fā)酵7 d后檢測漆酶活性。

1.2.2.3 金屬離子添加對產酶的影響

以MF為產漆酶基礎培養(yǎng)基，去除基礎培養(yǎng)基中相對應的離子，分別添加濃度為0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L的Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+，培養(yǎng)6 d，測定漆酶的活性(U/L)。

1.2.2.4 誘導劑對漆酶活性的影響

以MF為基礎產漆酶培養(yǎng)基，pH調至5.5，裝液量50 mL/瓶，種子菌齡為5 d，接種量5%，接種后第2 d添加不同誘導劑，誘導劑分別為藜蘆醇、ABTS、沒食子酸、單寧酸及愈創(chuàng)木酚，終濃度為0.025 mmol/L[13]。分別在第3、5、7、9、11 d測定酶活。

1.2.3 漆酶特性

1.2.3.1 最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

在pH 4.0的NaAc-HAc緩沖液中，分別在20、30、40、50、60、70、80℃條件下測定酶活，以酶活的最高值為100%，確定漆酶最適反應溫度；在上述不同反應溫度下繼續(xù)保溫10 min后，再次測定漆酶活性，以反應起始的酶活為對照，計算殘留酶活，確定其熱穩(wěn)定性。

1.2.3.2 最適反應pH

分別用pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制反應底物，測定漆酶活力。

1.2.3.3 pH穩(wěn)定性

將酶液加入pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制的底物，放入40℃的水浴中保溫24 h，測定酶活。

1.2.3.4 金屬離子對漆酶穩(wěn)定性的影響

用pH 4.0的NaAc-HAc緩沖液配制FeCl2、MnSO4、NaCl、CoCl2、ZnSO4、CaCl2、MgSO4、CuSO4、KCl、CdCl2、CrCl3、PbCl2、AgNO3、BaSO4溶液，使其終濃度為4 mmol/L，在最適反應溫度下，以不添加上述金屬離子的反應體系的酶活為100%，計算漆酶的相對活力。

1.2.4 LZ02漆酶蛋白性質

1.2.4.1 LZ02分泌蛋白SDS-PAGE

按最優(yōu)的發(fā)酵條件獲得漆酶發(fā)酵液，10 000 r/min、4℃、離心20 min，經過了30%～80%的硫酸銨分段鹽析、Macro-Prep DEAE弱陰離子交換層析和Bio-Gel P-60 凝膠過濾層析系列純化，純化產物進行SDS-PAGE電泳分析[14-16]，應用Bio-RAD quantity one軟件對蛋白分子量進行分析[16]。

1.2.4.2 蛋白雙向電泳、漆酶等電點測定及主要蛋白質譜

采用Bio-Rad蛋白質雙向電泳系統(tǒng)測定無柄靈芝菌LZ02漆酶的等電點，將漆酶發(fā)酵液經過10 000 r/min、4℃、離心20 min后，分別收集上清液和沉淀，使用pH 7.5、20 mmol/L的Tris·HCl緩沖液將沉淀沖洗4～5次，然后加入Tris·HCl緩沖液進行超聲波破碎(冷卻進行)后，10 000 r/min、4℃、離心10 min，取上清液進行透析過夜、濃縮至所需體積即可。上清液則可直接進行透析過夜、濃縮至所需體積。等電點聚焦使用了Bio-Rad的IPG預制膠條，pH為3.0～10，pH梯度為線性梯度，通過Bio-Rad PDQuest 2-D Analysis software軟件分析獲得酶蛋白等電點pI[17]。第二向SDS-PAGE電泳對無柄靈芝菌LZ02發(fā)酵產酶高峰時的菌體及發(fā)酵液進行上樣檢測對比分析。并將表達量高的漆酶蛋白點切下進行質譜測序分析。并將表達量高的漆酶蛋白點切下進行質譜測序并利用GPS Explor軟件進行分析[18]。

2 結果與分析

2.1 產漆酶發(fā)酵條件

2.1.1 碳源對LZ02產漆酶的影響

研究表明，以基礎產酶培養(yǎng)基中麥麩加葡萄糖(CK)的碳源組合酶活相對較高，為6 393 U/L，麥麩產酶活性為532 U/L；添加麥芽糖、蔗糖、甘油、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、淀粉替代基礎培養(yǎng)基中的麥麩加葡萄糖均未檢測到酶活，基礎培養(yǎng)基MF中麥麩加葡萄糖的碳源組合為最佳。圖1

注:1.麥芽糖；2.蔗糖；3.甘油； 4.葡萄糖；5.羧甲基纖維素鈉；6.淀粉；7.麥麩；8.對照

2.1.2 氮源對LZ02產漆酶的影響

研究表明，添加干酪素替代基礎培養(yǎng)基中的酒石酸銨時酶活最高，為6 365 U/L；其次為蛋白胨，酶活為5 343 U/L；再次為酵母粉，酶活為4 000 U/L；添加硝酸銨替代基礎培養(yǎng)基中的酒石酸銨時，酶活為2 364 U/L；添加硫酸銨和磷酸二氫銨替代基礎培養(yǎng)基中的酒石酸銨時，酶活分別為513和236 U/L；而以酒石酸銨(CK)作為氮源時，酶活為1 778 U/L，LZ02產漆酶的最佳氮源為干酪素，其次為蛋白胨。圖2。

注：1.干酪素；2.酵母粉；3.蛋白胨；4.硝酸銨；5.硫酸銨；6.磷酸二氫銨；7.對照

2.1.3 金屬離子濃度對LZ02產漆酶的影響

研究表明，Cu2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+的添加對LZ02產漆酶有一定的促進作用，其中0.5 mmol/L Cu2+、0.1 mmol/L的Mg2+、1和 2 mmol/L Fe2+、2 mmol/L Zn2+、0.1和 0.5 mmol/L Ca2+的效果最明顯。添加0.1 mmol/L的Mg2+在發(fā)酵第6 d所測得的酶活由對照組的0 U/L增加至4 276 U/L，1 mmol/L Fe2+在第6 d所測得的酶活由0增加到 5 150 U/L，添加0.1 mmol/L的Ca2+在發(fā)酵第6 d所測得的酶活由對照組的900 U/L增加至2 779 U/L，2 mmol/L Zn2+在第6 d所測得的酶活由1 171 U/L增加到 3 134 U/L；不同濃度Co2+的添加都使酶活明顯下降，Co2+對產酶具有抑制作用。圖3

圖3 添加不同金屬離子下LZ02產漆酶變化Fig.3 Effect of different metallic ion on the production of LZ02 laccase

2.1.4 誘導劑對LZ02產漆酶的影響

研究表明，藜蘆醇和愈創(chuàng)木酚抑制產酶并使產酶高峰由第3 d推后至第9 d，添加沒食子酸和ABTS對產酶影響不大；單寧酸對產酶具有抑制作用。圖4

圖4 不同誘導劑下LZ02產漆酶變化Fig.4 Effect of different inducer on the production of LZ02 laccase

2.2 漆酶部分酶學特性

2.2.1 LZ02漆酶的最適反應溫度

研究表明，以最高酶活性60℃條件下測定的LZ02漆酶活性為100%，20℃到80℃溫度區(qū)間內測定的反應液酶活分別為53.5%、64.7%、82.8%、97%、100%、84.4%、70%。圖5

圖5 LZ02漆酶最適反應溫度Fig.5 The optimum reaction temperature of laccase

2.2.2 LZ02漆酶的熱穩(wěn)定性

研究表明，40℃時穩(wěn)定性最好。圖6

圖6 LZ02漆酶熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of laccase

2.2.3 LZ02漆酶的最適反應pH

研究表明，pH為2.0到4.0時所測定的酶活相對較高，pH為2.0時酶活為1 161 U/L，pH 3.0時酶活為1 126 U/L，pH為4.0時,酶活為1 044 U/L，pH為5.0以上時所測酶活為0。圖7

圖7 LZ02漆酶最適反應pHFig.7 Optimal pH of laccase

2.2.4 LZ02漆酶pH穩(wěn)定性

研究表明，漆酶在40℃保溫24 h，pH 3.0～4.0時酶活較穩(wěn)定，pH 3.0時相對酶活為51.3%，pH 4.0時為59.3%，隨著pH值的升高酶活逐漸降低，超過pH 6.0時殘留酶活接近0。圖8

圖8 LZ02漆酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 pH on laccase stability

2.2.5 金屬離子對漆酶穩(wěn)定性的影響

研究表明，Mn2+、Zn2+、 Cu2+、Ba2+和K+對酶穩(wěn)定性有一定的促進作用，其中在含有Cu2+和Zn2+的pH 4.0的NaAc-HAc緩沖液反應體系中，所測酶活為對照的145%和133%， Na+和Ag+對酶穩(wěn)定影響不大；Co2+、Cd2+、Cr2+和Pb2+對酶的穩(wěn)定性具有明顯的破壞作用，其中加入Co2+時酶活為對照的57%；而Fe2+對漆酶活性完全抑制。圖9

圖9 不同金屬離子下LZ02漆酶穩(wěn)定性變化Fig.9 Effect of different metal ion on laccase stability

2.3 LZ02漆酶蛋白性質

2.3.1 SDS-PAGE電泳

研究表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有多種蛋白及多肽，發(fā)酵液上清在61 KD左右有較明顯的蛋白帶，經過離子交換層析后基本呈單一條帶，經過凝膠過濾層析后，SDS-PAGE電泳顯示只有1條蛋白帶。獲得的漆酶已經達到了電泳純級。根據(jù)標準蛋白相對分子量，得出木蹄層孔菌漆酶相對分子量約為61.5 KD。圖10

注：M.蛋白相對分子量標樣；1.硫酸銨鹽析(60%)；2.離子交換層析；3.硫酸銨鹽析(80%)；4.凝膠過濾層析

2.3.2 漆酶蛋白質雙向電泳及等電點

研究表明，菌體蛋白檢測出較多蛋白質點，而發(fā)酵液蛋白點則主要在同一等電點區(qū)域，酶蛋白pI為4.1，將菌體及發(fā)酵液表達量高的同一蛋白質點切下進行質譜分析。圖11

2.3.3 漆酶質譜

研究表明，對主要表達蛋白進行MALDI TOF/TOF質譜分析，利用GPS Explor軟件進行分析，MASCOT檢索NCBI Nr蛋白質數(shù)據(jù)庫，成功鑒定1個蛋白點(蛋白質得分>50，可信度>90)，鑒定的蛋白為Laccase(GanodermaLucidum)，其肽脂紋圖譜中有5條序列均與Laccase蛋白匹配。，表1

注：a.菌體；b.發(fā)酵液

表1 無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02漆酶質譜分析中基本信息和匹配的肽段序列Table 1 The basic information and match peptide sequences in mass spectrometry analysis of the laccase of G.resinaceum LZ02

3 討 論

漆酶的合成和分泌受到營養(yǎng)水平、培養(yǎng)條件、生長階段以及培養(yǎng)基中誘導劑的嚴格調控，木質素或木質素相關的芳香類化合物、N源和C源也能調節(jié)漆酶的合成[19-20]。

微生物酶類分為組成酶和誘導酶。組成酶是指微生物無論在任何培養(yǎng)基中，總是適量的存在的一些酶類；誘導酶是依賴于酶作用底物或底物結構類似物的存在而合成的酶類[21]。漆酶胞外組成酶產量較低，當添加與木質素或木質素衍生物相關的芳烴類和酚類誘導物時，能顯著提高漆酶酶活。Yuan等[22]研究發(fā)現(xiàn)不產漆酶菌株膠紅酵母(Rhodotorularmucilaginosa)與產漆酶菌株阿魏蘑(Pleurotuseryngiivar.ferulae)進行共培養(yǎng)時，可以有效提高漆酶發(fā)酵水平。Hao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ABTS、甲苯胺和對苯二酚對新疆野生巴爾喀什蘑菇產漆酶有明顯的促進作用，而咖啡酸、沒食子酸、鄰苯二酚、2，6-二甲氧基釀和愈創(chuàng)木酸對產酶誘導不明顯。研究表明[24，25]，Pb2+、Cd2+、Cu2+和Fe2+4種重金屬離子在液體培養(yǎng)條件下15個靈芝漆酶同工酶的轉錄表達影響存在差異性，其中5個漆酶基因(Glac4、Glac6、Glac10、Glac11和Glac12)轉錄表達發(fā)生上調。

4 結 論

確定0.5%酵母粉、2.5%麥麩、0.5%葡萄糖、0.5%磷酸二氫銨的最優(yōu)組合，此時漆酶活性可達10 863 U/L。白腐菌SHIHU-X2產漆酶的最優(yōu)培養(yǎng)基是：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨1.24 g/L，KH2PO41 g/L，酒石酸銨0.02 g/L，CuSO40.01 g/L，MgSO40.56 g/L，MnSO40.057 g/L。漆酶活力從初始產酶培養(yǎng)基1.11 U/mL 提高到響應面優(yōu)化后的2.32 U/mL，漆酶活力提高了109%。

無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02漆酶胞外分泌蛋白類型主要為Laccase(GanodermaLucidum)，獲得了該蛋白質的5個漆酶氨基酸序列片段。