盧欣雨，張曉偉，張佳興，趙勝宗，劉彥＊

（1.四川大學生物質(zhì)與皮革工程系，四川成都 610065；2.四川大學制革清潔技術(shù)國家工程實驗室，四川 成都 610065）

引言

我國是世界上最大的制革加工國，每年產(chǎn)生的制革固體廢棄物約30 萬噸[1]。由于處理和再利用方法的局限性，這些廢棄物給環(huán)保帶來了一定的壓力。制革廢棄物中的主要成分是重金屬鉻和膠原蛋白，如果對其進行適當?shù)奶幚?，每年至少? 萬噸膠原蛋白可以得到利用。目前，降解制革廢棄物的主要方式有酸法、堿法[2]和酶法[3]、以及微生物法[4]?；瘜W法是用制革廢棄物制備有機肥料的主要方式[5-15]，但化學法不僅對化學試劑的消耗量大，還會引入大量的鹽分雜質(zhì)，同時產(chǎn)生的氨基酸、多肽基本無生物活性。而酶法得到的基本上是多肽，產(chǎn)物單一。與化學法和酶法相比，生物發(fā)酵法才是農(nóng)業(yè)中制備有機肥料的主要方式。生物發(fā)酵制肥的條件溫和，蛋白質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵后可產(chǎn)生速效性的氨基酸、小分子肽、緩釋性的多肽等產(chǎn)物，營養(yǎng)全面，且產(chǎn)物皆有生物活性，更容易為植物所吸收利用。農(nóng)業(yè)使用的生物有機肥是以畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈、生活垃圾等有機廢棄物為基質(zhì)，經(jīng)過無害化、腐熟處理而制成的一類兼具有機肥和微生物功效的肥料[16]，已經(jīng)被廣泛證明具有能夠減少或代替部分化肥、農(nóng)藥的使用，增強作物抗逆性，改善作物品質(zhì)，改良土壤等優(yōu)勢，同時兼具促進作物生長和防控土傳病害功能[17]。因此，用微生物發(fā)酵降解制革廢棄物來制備生物有機肥料比化學法和酶法更具有前景。

由于高含量的鉻不利于微生物的繁殖生長，本研究擬采用脫鉻皮屑進行發(fā)酵降解。脫鉻皮屑的主要成分為膠原蛋白，微生物對其進行發(fā)酵降解后，會產(chǎn)生不同種類的游離氨基酸以及分子大小不一的多肽類物質(zhì)，這些物質(zhì)對植物的生長有促進和調(diào)節(jié)作用，因此，脫鉻皮屑的發(fā)酵產(chǎn)物可以作為氨基酸肥使用，對植物發(fā)揮營養(yǎng)、促生的功效。本文將對地衣芽孢桿菌發(fā)酵脫鉻皮屑的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，達到進一步提高脫鉻皮屑水解率，增加發(fā)酵液中游離氨基酸含量的目的。將以發(fā)酵液中的游離氨基酸種類及含量評估發(fā)酵效果，并對其重金屬含量進行測定，以評估脫鉻皮屑發(fā)酵液作為生物有機緩釋肥的可行性。

1 實驗部分

1.1 主要材料與儀器

P-4 菌：取1 mL 自然降解的廢皮液，用無菌水稀釋后在明膠培養(yǎng)基上進行劃線分離，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑選出培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落，將其于液體種子培養(yǎng)基中活化12 h，取種子液在固體種子培養(yǎng)基上劃線并培養(yǎng)24 h。將獲取的單菌落通過點種接種到明膠培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h，得到初篩菌株。將初篩菌株于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，以1%接種量接種到添加了一定量脫鉻皮屑的發(fā)酵培養(yǎng)基中（比例為1 g 的脫鉻皮屑加20 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基），培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液中游離氨基含量最高的那組即為本實驗所需的菌株，經(jīng)16SrDNA 法鑒定可基本確定為地衣芽孢桿菌。

脫鉻皮屑：本實驗室自制[18]。將藍濕皮碎塊用打磨機粉碎成屑，以一定量的鉻革屑為基重，加入10%的9 g/L 氧化鈣和2000%的水，在25 ℃、120 r/min 的水浴振蕩下，反應12 h 后抽濾。取濾屑，加入0.9 mol/L 的鹽酸（固液比1∶20）處理35 min 后，離心去溶液后固體水洗數(shù)次，然后干燥至恒重?；曳趾繛?.26%，總鉻含量為0.819 mg/g，pH 值為7.0。

材料：試劑均為國產(chǎn)分析純；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；SDS-PAGE 標準蛋白質(zhì)（相對分子質(zhì)量范圍14～66 kDa），合肥博美生物。

儀器：SHA-B 雙功能水浴恒溫振蕩器，常州市億能實驗儀器廠；HSP-80B 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海坤天實驗儀器有限公司；SQP 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV-1100 型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；PHS-3C 精密酸度計，上海儀分科學儀器有限公司；ICP-OES 等離子發(fā)射光譜儀，美國Perkin Elmer；DYY-2C 垂直板型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HG-AFS 氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀，北京科創(chuàng)海光儀器有限公司。

1.2 實驗內(nèi)容與方法

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1000 mL。

明膠培養(yǎng)基：明膠25 g，磷酸二氫鉀2 g，氯化鈉5 g，七水硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，水1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀14 g，磷酸二氫鉀6 g，氯化鈉5 g，七水硫酸鎂0.2 g，檸檬酸鈉1 g，硫酸銨2 g，瓊脂20 g，水1000 mL。

培養(yǎng)基的pH 均用氫氧化鈉調(diào)到8.0。

1.2.2 發(fā)酵條件研究

挑取在平板劃線中生長良好的P-4 菌單菌落，接種到已滅菌的液體種子培養(yǎng)基（20 mL）中，置于37 ℃、120 r/min 的恒溫振蕩水浴器中培養(yǎng)。

1.2.2.1 接種菌齡[19]

每隔4 個小時取一次樣，以蒸餾水作空白，在600 nm 波長下測定OD 值，至數(shù)值基本不變后停止取樣，以OD 值和培養(yǎng)時長為坐標軸繪制P-4 菌的生長曲線圖。

1.2.2.2 固液比

培養(yǎng)24 h，取種子液備用。稱取一定量的脫鉻皮屑，與發(fā)酵培養(yǎng)基按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25 的比例進行混合，即1 g 的脫鉻皮屑分別加5、10、15、20 和25 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，下同。混勻后調(diào)pH 值至8.0，置于121 ℃的滅菌鍋中滅菌20 min。冷卻后以1%的接種量接入種子液，置于37℃、120 r/min 的恒溫振蕩水浴器中培養(yǎng)24 h 后測定游離氨基的含量。

1.2.2.3 接種量、最適溫度、最適pH

培養(yǎng)24 h，取種子液備用。脫鉻皮屑與發(fā)酵培養(yǎng)基按照1∶15 的比例進行混合（同1.2.2.2），混勻后調(diào)節(jié)pH 值至8.0（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0），置于121℃的滅菌鍋中滅菌20 min。冷卻后以0.5%(0.5%、1%、2%、3%、4%)的接種量接入種子液，置于恒溫振蕩水浴器中，在37 ℃(27、32、37、42、47 ℃)、120 r/min 下培養(yǎng)，每6 個小時取一次樣，并測定相應時間下游離氨基的含量。

1.2.2.4 發(fā)酵時間

調(diào)pH 值為9.0，其余步驟同1.2.2.3。

1.2.3 發(fā)酵液中游離氨基的測定[20-21]

茚三酮溶液：稱取0.5 g 茚三酮，用無水乙醇溶解并定容于100 mL 棕色容量瓶中；乙酸-乙酸鈉緩沖液：稱取120.0 g 乙酸鈉，加入4.0 mL 無水乙酸，加水定容于1000 mL 容量瓶中；碘酸鉀溶液：稱取0.3 g 碘酸鉀，加入90 mL 蒸餾水溶解后加60 mL無水乙醇；標準溶液：稱取0.1 g 甘氨酸，加水定容于100 mL 棕色容量瓶中，再分別取0、1、2、3、4、5 mL 該甘氨酸溶液于100 mL 容量瓶中定容。

準確吸取1 mL 標準溶液分別置于6 支比色管中，依次加入1 mL 緩沖液和茚三酮溶液，封好搖勻后于沸水浴中加熱15 min，取出放到冷水中冷卻15 min。再分別加入5 mL 碘酸鉀溶液，用蒸餾水定容至10 mL。將波長調(diào)至568 nm，用空白樣調(diào)零，再依次測出其余樣品的吸光度。以游離氨基含量和吸光度為坐標軸繪制標準曲線，得到線性回歸方程。將標準溶液換成稀釋后的發(fā)酵液，其吸光度的測定同上。根據(jù)上述線性回歸方程得到游離氨基的含量。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物主要成分分析

脫鉻皮屑在其最優(yōu)條件下發(fā)酵后，對發(fā)酵液的主要成分進行測定。

1.2.4.1 重金屬含量

按照DB33/T 647—2007 中硝酸-高氯酸濕法對發(fā)酵液進行消解，用ICP-OES 法測定樣品中鎘、鉻、鉛的含量；按照NY/T 1978-2010 中原子熒光光譜法檢測樣品中汞、砷的含量[22]。

1.2.4.2 游離氨基酸種類及含量

于帶有過濾膜的小離心管中放入400 μL 發(fā)酵液，100 μL 10%磺基水楊酸，混勻，置于冰箱中在2～8 ℃下靜置冷藏60 min。然后將其置于離心機中以5000 r/min 離心15 min，接著取上層清液再次以5000 r/min 離心5 min。離心結(jié)束后，取上清液，根據(jù)發(fā)酵液中游離氨基酸的大概濃度，對發(fā)酵液進行稀釋，使得其游離氨基酸濃度在50～250 nmol/mL 之間。樣品稀釋后，用0.22 μm 濾膜過濾，在A300 全自動氨基酸分析儀上進行氨基酸分析。

1.2.4.3 多肽含量[23]

采用雙縮脲法測定。取6 支試管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 的5 mg/mL 標準蛋白溶液，用水補足到1 mL。再加入4 mL 的雙縮脲試劑，充分搖勻后于25 ℃下靜置30 min。在540 nm 的波長下測定吸光度，以牛血清蛋白含量和吸光度為坐標軸繪制標準曲線，得到線性回歸方程。

取2 mL 發(fā)酵液，加入2 mL 15%三氯乙酸，混勻后靜置10 min，以5000 r/min 離心10 min。取1 mL經(jīng)適度稀釋的上清液，余下步驟同上。根據(jù)標準曲線中的線性關(guān)系，將發(fā)酵液的吸光度換算為相應的多肽含量。

1.2.4.4 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布

開始發(fā)酵后每12 h 取一次樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳法測定不同時間點下蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。制膠配方如表1 所示，制膠完成后，用微量注射器分別取適量Marker 和處理好的樣品注入進樣槽中。接通電源，設置電壓為80 V，待樣品進入分離膠時，調(diào)節(jié)電壓至150 V。待溴酚藍色染料距離凝膠邊緣約1～2 cm 時，結(jié)束電泳。關(guān)掉電源，取出膠片，膠片經(jīng)染色、脫色后得到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

表1 SDS-PAGE 法制膠配方Tab. 1 Gel formula of SDS-PAGE

2 結(jié)果與討論

在發(fā)酵降解的過程中，發(fā)酵條件是影響微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素，主要為菌齡、接種量、溫度、pH 和時間等，這些條件的改變都會直接影響發(fā)酵的結(jié)果[24]。溫度和pH 值是影響菌株生長和代謝體系酶活最主要的因素，每一種菌都有自己最適宜的溫度和pH，一旦偏離了其最適值，均可能造成發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的急劇降低和發(fā)酵的失敗。發(fā)酵時間是獲取產(chǎn)物種類和數(shù)量的重要指標，尤其是產(chǎn)物為中間代謝產(chǎn)物的，控制不當就有可能造成其被微生物利用掉的后果，最終造成發(fā)酵目標產(chǎn)物產(chǎn)率低下。因此，根據(jù)發(fā)酵最終產(chǎn)物的不同對發(fā)酵條件進行研究和優(yōu)化是提高其產(chǎn)量的有效方式之一。

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 接種菌齡

由圖1 可知，OD 值在0～4 h 增長緩慢，P-4 菌處于延滯期；4～24 h 期間OD 值呈近直線型增長，P-4 菌處于對數(shù)生長期；24 h 后P-4 菌開始步入穩(wěn)定期。對數(shù)生長期后期的菌株生長和代謝能力旺盛，菌株數(shù)量基本達到了最高，因此選取24 h 作為P-4 菌的接種菌齡。

圖1 P-4 菌株生長曲線Fig. 1 Growth curve of strain P-4

2.1.2 固液比

圖2 數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵液中游離氨基含量隨著固液比的增大而明顯增加，在1∶15 時達到最高，當繼續(xù)增大后含量趨于平緩。這是因為固液比太小時，發(fā)酵液中有機營養(yǎng)濃度過高，發(fā)酵液黏度過大而溶氧不足，抑制了微生物的生長和代謝。同時，固液比過大對產(chǎn)物量的增加沒有促進作用，反而會增加發(fā)酵罐的載荷負擔和水耗量。因此，最佳固液比為1∶15。

圖2 固液比對脫鉻皮屑水解的影響Fig. 2 The effect of solid-liquid ratio on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.3 接種量

由圖3 可知，發(fā)酵6～24 h 時接種量越大，發(fā)酵液中的游離氨基含量越高；超過24 h 后，不同接種量的發(fā)酵液中游離氨基含量之間幾乎無差異。這可能是因為在發(fā)酵前期，接種量越大，發(fā)酵液中的活菌數(shù)量越多，產(chǎn)生的游離氨基含量就越高，但隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)量趨于相同，導致其游離氨基含量差異越來越小。在接種量為0.5%的基礎上繼續(xù)增大接種量并沒有增加游離氨基含量，反而浪費種子液，增加發(fā)酵成本，因此接種量取0.5%。

圖3 接種量對脫鉻皮屑水解的影響Fig. 3 The effect of inoculation amount on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.4 最適溫度

圖4 顯示，在同一發(fā)酵時間點下，不同溫度的發(fā)酵液游離氨基含量并不都隨溫度的升高而增加。溫度過高或過低都會影響P-4 菌株的代謝活動，導致游離氨基含量較低。因此可以看出，37 ℃是P-4菌株降解脫鉻皮屑的最適溫度。

圖4 溫度對脫鉻皮屑水解的影響Fig. 4 The effect of temperature on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.5 最適pH

由圖5 可以看出，pH 對脫鉻皮屑水解的影響與發(fā)酵溫度的影響規(guī)律相似，說明pH 過高或過低都會影響P-4 菌株的代謝活動，從而影響發(fā)酵液中的游離氨基含量。此實驗范圍內(nèi)，9 是P-4 菌株降解脫鉻皮屑的最適pH 值

圖5 pH 對脫鉻皮屑水解的影響Fig. 5 The effect of pH on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.6 發(fā)酵時間

由圖6 可以看出，發(fā)酵12～24 h 時，發(fā)酵液中的游離氨基含量急速上升，此時P-4 菌株的代謝非?；钴S，菌株不斷地分泌胞外蛋白酶，使得脫鉻皮屑由大分子的蛋白質(zhì)逐漸分解為小相對分子質(zhì)量的游離氨基酸和多肽；發(fā)酵24～48 h，游離氨基含量上升變緩，于48 h 時達到最高值。此時盡管P-4 菌株的代謝速度放緩，但氨基酸和多肽的產(chǎn)生速率還是遠遠高于菌株的代謝消耗速率，所以游離氨基的含量不斷增加；發(fā)酵48～72 h，游離氨基含量出現(xiàn)緩慢下降的趨勢。此時脫鉻皮屑的生物降解基本完成，降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)作為菌株的營養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗，出現(xiàn)了產(chǎn)物阻遏效應。因此，P-4 菌株發(fā)酵48 h 時，游離氨基含量最高，發(fā)酵效果最佳。

圖6 發(fā)酵時間對脫鉻皮屑水解的影響Fig. 6 The effect of fermentation time on hydrolysis of dechromed shavings

綜上所述，優(yōu)化的發(fā)酵條件為：菌齡24 h，固液比1∶15，接種量0.5%，溫度37 ℃，pH 9.0 和發(fā)酵時間48 h。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物成分的分析

脫鉻皮屑發(fā)酵過后已經(jīng)被水解成液體狀態(tài)，無肉眼可見的皮屑等固體殘留物。

2.2.1 重金屬含量

由表2 可知，脫鉻皮屑發(fā)酵液中未檢測到汞、砷、鎘、鉛，而鉻的含量也只有2.91 mg/kg，完全符合農(nóng)業(yè)部標準NY 1110-2010 對水溶肥料的要求[25]。

表2 重金屬含量Tab. 2 Contents of heavy metal

2.2.2 游離氨基酸

由表3 可知，發(fā)酵液中游離氨基酸質(zhì)量濃度最高的為脯氨酸，其次為半胱氨酸、丙氨酸和組氨酸，這些氨基酸能夠為植物生長提供快速營養(yǎng)供給?？偘被豳|(zhì)量濃度達到了1 g/L，按照目前市售氨基酸肥料的施用質(zhì)量濃度為100 mg/L 計，發(fā)酵液可以至少稀釋10 倍后用于植物種植。

表3 游離氨基酸質(zhì)量濃度Tab. 3 Contents of free amino acid

2.2.3 多肽含量

用三氯乙酸去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)分子后，采用雙縮脲法，測得發(fā)酵結(jié)束時(48 h)發(fā)酵液中的多肽質(zhì)量濃度為13.21 g/L。多肽同氨基酸一樣，皆能夠明顯改善作物品質(zhì)，提高作物產(chǎn)量以及增強作物的抗逆性。但多肽還具有緩釋肥效的功能，能夠更持久地為植物提供營養(yǎng)。因此，本實驗制備的脫鉻皮屑發(fā)酵液有希望用作營養(yǎng)均衡、豐富的植物營養(yǎng)液。

2.2.4 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布

圖7 顯示，發(fā)酵12 h 后，蛋白質(zhì)條帶呈清晰的連續(xù)狀分布，且相對分子質(zhì)量較大，基本都在20.0 kda 及以上，此時尚處于起始階段；24 h 后，凝膠圖上只有模糊的蛋白質(zhì)條帶，尤其是48 h 以后，在標準蛋白相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)基本看不到蛋白質(zhì)條帶，說明此時脫鉻皮屑已被充分降解為相對分子質(zhì)量更小的游離氨基酸和多肽，且多肽相對分子質(zhì)量皆在14.4 kda 以下。由此可知，經(jīng)過P-4 菌株發(fā)酵處理48 h 后，脫鉻皮屑已經(jīng)降解為氨基酸和小相對分子質(zhì)量多肽，發(fā)酵液中大量存在的游離氨基酸可以為處于迅速生長期的植物提供快速均衡的營養(yǎng)保障，豐富的多肽含量還可為植物生長提供源源不斷的緩釋營養(yǎng)供給。

3 結(jié)論

（1）優(yōu)化的P-4 菌株（地衣芽孢桿菌）發(fā)酵條件為：種子液菌齡24 h，固液比1∶15，接種量0.5%，溫度37 ℃，pH 9.0 和發(fā)酵時間48 h。

（2）脫鉻皮屑發(fā)酵液中未檢測到汞、砷、鎘和鉛元素，鉻質(zhì)量分數(shù)為2.91 mg/kg，重金屬含量皆達到了農(nóng)業(yè)部國家標準。

（3）發(fā)酵液中游離氨基酸主要有脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和組氨酸，總游離氨基酸質(zhì)量濃度達到了1 g/L。

（4）發(fā)酵液中總肽質(zhì)量濃度為13.21 g/L，說明脫鉻皮屑發(fā)酵液中含有較高濃度的游離氨基酸和大量的多肽類物質(zhì)。

（5）脫鉻皮屑在最優(yōu)條件下發(fā)酵48 h 后，基本降解為游離氨基酸和相對分子質(zhì)量更小的多肽類物質(zhì)，且相對分子質(zhì)量都在14.4 kda 以下，有望作為生物有機緩釋肥促進植物的生長。