呂青青，秦 琴，涂治驍，肖世平，楊彩梅，劉玉蘭，肖 勘*

（1.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313307）

腸道不僅承擔著消化和吸收營養(yǎng)物質的重要功能，同時還作為機體內表面積最大的器官與外界環(huán)境有著直接的接觸，隨時受到內外環(huán)境中不利因素的刺激，從而引起腸上皮損傷、腸道功能障礙，最終誘發(fā)腸道疾病。腸道屏障完整對于抵御內源性和外源性有害物質的入侵十分重要。腸道的物理屏障由一層柱狀上皮細胞和上皮細胞間的緊密連接蛋白組成，腸上皮細胞是構成腸道黏膜的關鍵成分，通過與緊密連接蛋白相互作用共同防止有害抗原、微生物及其毒素侵入機體。已有許多研究通過培養(yǎng)豬小腸上皮細胞系（IPEC-1）構建體外腸道模型。腸上皮細胞對腫瘤壞死因子-（TNF-）等炎性細胞因子十分敏感，因此本試驗采用TNF-刺激來構建IPEC-1 細胞損傷模型。

腸道損傷與細胞死亡有密切關系。隨著生命科學研究領域的不斷進展，細胞程序性壞死逐漸引起人們的注意。程序性壞死主要是由受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）、受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）和混合系激酶樣結構域蛋白（MLKL）介導的，它結合了細胞凋亡和壞死的特征。近年來，程序性壞死被證明在多種因素引起的組織損傷中發(fā)揮重要作用，如心臟、腦缺血再灌注和腸道炎癥，但有關豬腸道程序性壞死的研究報導較少。因此，本試驗旨在探究TNF-刺激是否能激活IPEC-1 細胞程序性壞死信號通路，同時誘導IPEC-1 細胞損傷、細胞間緊密連接的破壞和屏障功能障礙，探索關于腸道損傷和腸上皮細胞死亡的新機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 IPEC-1 細胞來自德克薩斯農(nóng)工大學；DMEM/F-12 培養(yǎng)基購自HyClone 公司；TNF-、熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖4（FITC-dextran，F(xiàn)D4）購自Sigma-Aldrich 公司。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；Cell Counting Kit（CCK8）試劑盒購自武漢丁香園生物科技有限公司；臺盼藍購自Solarbio 公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制 在DMEM-F12 培養(yǎng)基中按比例加入5%的胎牛血清（FBS）、1%的胰島素-轉鐵蛋白-硒-X（ITS-X）、1%的青鏈霉素混合液（PSF）和0.5‰的表皮生長因子（EGF），配制成完全培養(yǎng)基，經(jīng)無菌過濾操作后使用。

1.3 細胞培養(yǎng) 復蘇IPEC-1 細胞，在含有5%CO、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基。當貼壁細胞量達到90%～95%時，用胰酶消化。終止消化后，1 500 r/min 離心5 min，棄上清重懸，適當稀釋細胞懸液、鋪板培養(yǎng)。

1.4 指標測定

1.4.1 細胞活力 將細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，當貼壁細胞量達到70%后，用含有50 ng/mL TNF-的培養(yǎng)液刺激細胞，對照組培養(yǎng)液中加入等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為溶劑對照，培養(yǎng)細胞48 h。刺激結束后，用含有CCK8 的培養(yǎng)基（CCK8 和完全培養(yǎng)基按1:9 配制），置于37℃恒溫避光孵育1.5 h 后，立即用酶標儀在波長450 nm 處測吸光度。

1.4.2 LDH 活性 將細胞接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，細胞處理同上。收集細胞培養(yǎng)上清液，用LDH 試劑盒檢測上清液中的LDH 活性。

1.4.3 細胞數(shù)量 將細胞接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，細胞處理同上。刺激結束后，棄培養(yǎng)液，用PBS 清洗2 遍，每孔加入500 μL 胰酶消化離心后加入1 mL PBS 吹打混勻。取10 μL 細胞懸液與 90 μL 0.5% 臺盼藍染液混合均勻，點樣于血球計數(shù)板上，放在低倍鏡下（10×10 倍）觀察，計數(shù)4 個大方格內的細胞總數(shù)。

1.4.4 跨上皮電阻（TEER）和FD4 通透性 將細胞接種于12 孔Transwell 板中，上室加入0.5 mL 細胞懸液，下室加入1.5 mL 全培。第4 天后，每天用Milicell-ERS 電阻儀測量電阻值并記錄，培養(yǎng)至細胞TEER 值趨于穩(wěn)定，再用50 ng/mL TNF-+1 mg/mL FD4 共同處理48 h，測定TEER，在每個下室中吸取50 μL 培養(yǎng)基至96 孔板中，用全功能酶標儀測定培養(yǎng)基中FD4 的發(fā)光度，最后計算FD4 的濃度。

1.4.5 緊密連接蛋白的分布 將細胞接種于共聚焦小皿中，每孔加入1 mL 細胞懸液，待細胞長至70%后，用含50 ng/mL TNF-的培養(yǎng)液刺激細胞48 h，參照Xiao等的方法制備樣品后放于激光共聚焦顯微鏡下拍照并進行熒光定量。

1.4.6 程序性壞死信號通路關鍵基因mRNA 表達量 將細胞接種于12 孔板中，細胞處理同上，刺激結束后用RNA 裂解液收取細胞，用于程序性壞死關鍵基因mRNA 表達的測定。RNA 提取、定量和分析方法參照李佩等。相關基因的引物序列見表1。

表1 相關基因的引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 24.0 軟件進行獨立樣本檢驗，結果以平均值±標準誤表示，以<0.05 為差異顯著性標準，0.05<<0.10 為具有顯著性趨勢。

2 結果與分析

2.1 TNF-對IPEC-1 細胞生長和損傷的影響 由圖1可知，與對照組相比，TNF-刺激使IPEC-1 細胞活力下降（<0.001），細胞培養(yǎng)液中LDH 活性升高（<0.05），IPEC-1 細胞數(shù)量減少（<0.05）。

圖1 TNF-α 對IPEC-1 細胞活力、LDH 活性和細胞數(shù)量的影響

2.2 TNF-對IPEC-1 細胞上皮屏障功能的影響 由圖2可知，與對照組相比，TNF-刺激使IPEC-1 細胞跨上皮電阻降低（<0.05），F(xiàn)D4 通透性增加（<0.05）。

圖2 TNF-α 對IPEC-1 細胞TEER 值（a）和FD4 通透性（b）的影響

2.3 TNF-對IPEC-1 細胞緊密連接蛋白分布的影響由圖3 可知，對照組細胞間的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 均勻地分布于細胞的邊界，但TNF-處理導致細胞膜上Occludin 和ZO-1 分布紊亂，表現(xiàn)為緊密連接蛋白的斷裂和邊界模糊變淡。對Occludin 和ZO-1 的熒光強度定量也同樣表明，與對照組相比，TNF-刺激使Occludin（<0.001）和ZO-1（<0.05）的表達量降低。

圖3 TNF-α 刺激IPEC-1 細胞48 h 對Occludin（a）和ZO-1（b）蛋白表達和分布的影響

2.4 TNF-對IPEC-1 細胞程序性壞死關鍵基因mRNA表達量的影響 由圖4 可知，與對照組相比，TNF-刺激增加了和的mRNA 表達量（<0.05），但對的mRNA 表達量無顯著影響。

圖4 TNF-α 對IPEC-1 細胞程序性壞死關鍵基因RIP1（a）、RIP3（b）和MLKL（c）mRNA 表達的影響

3 討論

腸道在維持機體健康方面發(fā)揮著重要作用，腸道屏障可以選擇性地吸收對機體有利的營養(yǎng)物質、水分和電解質等，而將對機體有害的病原體等物質阻攔在外。大量研究表明，TNF-與包括腸上皮細胞在內的多種類型細胞的損傷有關。本研究使用TNF-誘導的IPEC-1 細胞損傷模型來探索TNF-對IPEC-1 細胞程序性壞死的影響。

細胞活力、細胞上清液中LDH 活力和細胞數(shù)量可反映細胞的生長狀況和細胞損傷程度。LDH 是一種細胞內酶，當細胞受損時，胞內的LDH 會大量釋放到胞外。本試驗結果顯示，TNF-刺激導致細胞活力顯著下降，同時使細胞上清中LDH 活力顯著升高，表明TNF-刺激誘導了IPEC-1 細胞損傷。腸上皮細胞大量死亡會導致腸上皮結構和屏障的破壞，而腸上皮屏障的完整性和通透性可以通過TEER 值和FD4 的通透性來反映。當腸道受損時，腸上皮細胞會失去其選擇透過性，使一些小分子物質能夠輕易穿過上皮層。因此通過測量下室培養(yǎng)液中FD4 濃度可用來反映TNF-刺激后IPEC-1 細胞通透性改變的情況。本試驗中TNF-刺激使IPEC-1 細胞跨上皮電阻顯著降低，同時FD4 通透性顯著增加，表明TNF-可以損害IPEC-1的屏障功能。

腸上皮細胞間的緊密連接依靠Occludin 和ZO-1 等蛋白間的相互作用來發(fā)揮其屏障功能，因此，緊密連接蛋白的任何改變都會直接導致屏障功能的損害。據(jù)報道，TNF-可通過許多信號通路誘導緊密連接蛋白損失，與Xiao 等、Mankertz 等研究結果一致的是，本試驗中TNF-刺激使Occludin 和ZO-1 蛋白表達量降低，蛋白分布紊亂，表明TNF-破壞了IPEC-1 細胞間的緊密連接。

當細胞受到TNF-刺激后，TNF-會與膜上相應的受體TNFR1 結合，進而在胞質端募集一系列的蛋白質形成復合體，在合適的條件下，這些復合體會使磷酸化的RIP1、RIP3 和MLKL 進一步募集而形成壞死復合體，進而引發(fā)程序性壞死。在程序性壞死信號通路激活的過程中，RIP1、RIP3 和MLKL 是關鍵的調節(jié)蛋白，其表達量升高表明它們將大量聚集而促進程序性壞死的發(fā)生。有研究證明，通過敲除RIP 激酶基因能阻止程序性壞死的形成或激活。本試驗中TNF-刺激增加了和的mRNA 表達量，表明TNF-刺激誘導了IPEC-1 細胞程序性壞死信號的激活。

TNF-與腸道損傷密切相關，本研究結果顯示TNF-刺激激活了IPEC-1 細胞程序性壞死信號通路中和的表達，為研究腸道損傷機制提供了新的方向，為后續(xù)通過營養(yǎng)調控腸道程序性壞死奠定基礎。

4 結論

本試驗結果表明，TNF-刺激可導致IPEC-1 細胞活力下降和細胞損傷、細胞間緊密連接破壞以及屏障功能障礙，激活了細胞程序性壞死信號通路。