王 慧，郭俊杰，李先根，任效瑞，劉玉蘭，楊彩梅，朱惠玲*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 4 300232；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313307）

仔豬斷奶應(yīng)激在規(guī)?；⒓s化養(yǎng)豬生產(chǎn)中日益成為一個(gè)比較嚴(yán)重的問(wèn)題，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。斷奶應(yīng)激激活相關(guān)應(yīng)激信號(hào)通路，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，繼而引起仔豬發(fā)生腹瀉。甘氨酸（Gly）作為幼齡哺乳動(dòng)物條件性必需氨基酸，具有抗炎、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抑制氧化應(yīng)激等功能。研究表明，體外添加Gly 對(duì)腸黏膜屏障功能有調(diào)控作用。因此，本試驗(yàn)用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)仔豬腸黏膜損傷，探究在日糧中添加Gly 對(duì)斷奶仔豬腸黏膜屏障損傷的保護(hù)作用，為養(yǎng)豬生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用體重相近的（21±1）日齡杜× 長(zhǎng)× 大斷奶仔豬24 頭，平均體重為（7.17±0.17）kg，隨機(jī)分為4 組，每組6 個(gè)重復(fù)（欄），每欄1 頭豬。4 個(gè)處理組分別為對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）、LPS 組（基礎(chǔ)日糧+LPS）、1.0% Gly 組（基礎(chǔ)日糧+1.0% Gly+LPS）（L-Gly，有效成分均大于99%，武漢阿米諾科技有限公司）、2.0% Gly 組（基礎(chǔ)日糧+2.0% Gly+LPS）。預(yù)飼7 d，正試期28 d。在試驗(yàn)第28 天，對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水，LPS 組、1.0% Gly 組和2.0% Gly 組仔豬腹腔注射LPS（大腸桿菌血清型O55：B5，Sigmaaldrich，美國(guó)），劑量為100 μg/kg BW?；A(chǔ)日糧配制參照NRC（2012）仔豬營(yíng)養(yǎng)需要，按照文獻(xiàn)配方配制。各組日糧用丙氨酸進(jìn)行等氮處理。

1.2 小腸樣品采集 試驗(yàn)第28 天，注射LPS 或生理鹽水4 h 后，仔豬麻醉、屠宰，取空腸、回腸黏膜標(biāo)本，置于超低溫冰箱-80℃保存。另取空腸和回腸2 cm 用于小腸形態(tài)學(xué)觀察（4%多聚甲醛固定，HE 染色）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定 在試驗(yàn)開(kāi)始第1 天和第28 天，空腹12 h 后仔豬稱重，記錄采食量，計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定 按照商品試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)測(cè)定空腸、回腸的黏膜谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平。

1.3.3 細(xì)菌移位率及移位細(xì)菌數(shù)測(cè)定 無(wú)菌采集仔豬的脾臟、肝臟以及腸系膜淋巴結(jié)，稱取脾臟、肝臟及腸系膜淋巴結(jié)約0.1 g，勻漿、接種至鮮血-麥康凱培養(yǎng)基，于37℃細(xì)菌培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。培養(yǎng)板上出現(xiàn)菌落定義為細(xì)菌移位陽(yáng)性，計(jì)算細(xì)菌移位率，細(xì)菌移位率=移位組織個(gè)數(shù)/組織總數(shù)×織總數(shù)個(gè)；菌落計(jì)數(shù)用于計(jì)算移位細(xì)菌數(shù)，移位細(xì)菌數(shù)的單位為log（CFU/g）。

1.3.4 小腸組織形態(tài)學(xué)觀察 參照Z(yǔ)hu 等方法測(cè)定絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度值。

1.3.5 腸黏膜杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù) 參照Z(yǔ)hu 等方法計(jì)數(shù)空腸、回腸杯狀細(xì)胞數(shù)及腸上皮細(xì)胞總數(shù)，杯狀細(xì)胞數(shù)按公式計(jì)算，即杯狀細(xì)胞數(shù)=杯狀細(xì)胞數(shù)/腸上皮細(xì)胞總數(shù)×100%，取平均值為該組織杯狀細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞計(jì)數(shù) 參照Z(yǔ)hu 等方法對(duì)空腸、回腸嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)，并測(cè)量視野面積，計(jì)算嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞密度，細(xì)胞密度=細(xì)胞數(shù)/視野面積，取平均值為該組織嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞密度。

1.3.7 小腸黏膜信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素（）、促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素受體1（）、促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素受體2（）、糖皮質(zhì)激素受體（）、類(lèi)胰蛋白酶（）等mRNA水平采用Real-time PCR 分析。內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶（），采用2法計(jì)算。Realtime PCR 所需試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05 為差異顯著，<0.10 為具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響 由表2可知，試驗(yàn)第1～28 天各處理組ADG、ADFI 及F/G 沒(méi)有顯著差異。

表2 Gly 對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

2.2 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜MDA 和GSH水平的影響 由圖1、2 可知，LPS 應(yīng)激顯著升高回腸MDA 水平（<0.05），降低空腸、回腸GSH 水平（<0.05）；日糧添加1.0% Gly、2.0% Gly 緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的回腸MDA 升高（<0.05）及GSH 降低（<0.05）。

圖1 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜MDA 水平的影響

2.3 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸形態(tài)學(xué)的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，LPS 應(yīng)激使空腸絨毛高度/隱窩深度比值降低（<0.05），且有降低空腸絨毛高度趨勢(shì)（<0.1）。與LPS 組相比，日糧中添加Gly 對(duì)小腸結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響。

表3 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸形態(tài)學(xué)的影響

2.4 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬細(xì)菌移位率及移位細(xì)菌數(shù)的影響 由表4、5 可知，與對(duì)照組相比，LPS 應(yīng)激增加細(xì)菌移位率；與LPS 組相比，日糧添加Gly 降低細(xì)菌移位率，但差異均不顯著。與對(duì)照組相比，LPS 應(yīng)激增加脾臟移位細(xì)菌數(shù)（<0.05），且有增加肝臟移位細(xì)菌數(shù)的趨勢(shì)（<0.1）；與LPS 組相比，2.0% Gly 組肝臟移位細(xì)菌數(shù)顯著降低。

表4 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬細(xì)菌移位率的影響

圖2 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜GSH 水平的影響

2.5 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜免疫細(xì)胞的影響 由表6 可知，與對(duì)照組相比，LPS 應(yīng)激增加斷奶仔豬回腸肥大細(xì)胞密度（<0.05），且有增加空腸杯狀細(xì)胞數(shù)的趨勢(shì)（<0.1）；與LPS 組相比，日糧添加1.0% Gly 降低空腸肥大細(xì)胞數(shù)及回腸嗜中性粒細(xì)胞密度（<0.05），且有降低回腸肥大細(xì)胞密度的趨勢(shì)（<0.1）；而日糧添加2.0% Gly 有降低空腸嗜中性粒細(xì)胞密度的趨勢(shì)（<0.1）。

表5 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬移位細(xì)菌數(shù)的影響 log10（CFU/g）

表6 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜免疫細(xì)胞影響

2.6 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響 由表7 可知，與對(duì)照組相比，LPS 應(yīng)激增加空腸（<0.05）、（<0.001）和（<0.05）及回腸（<0.001）的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。與LPS 組相比，1.0%Gly 組空腸及回腸mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低，2.0% Gly 組空腸及回腸mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低。

表7 Gly 對(duì)LPS 應(yīng)激斷奶仔豬小腸黏膜CRF/CRFR1信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

Gly 是體內(nèi)最簡(jiǎn)單的氨基酸，它不僅參與蛋白質(zhì)、嘌呤等合成，其在氧化損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等方面也發(fā)揮重要作用。Gly 對(duì)動(dòng)物腸黏膜屏障功能有一定的改善作用。本試驗(yàn)用LPS 誘導(dǎo)仔豬腸黏膜損傷，探究Gly對(duì)斷奶仔豬腸黏膜屏障損傷的保護(hù)作用。

體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS 應(yīng)激可使機(jī)體自由基（如活性氧）生成增多，抗氧化能力下降，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。MDA 水平反映組織氧化應(yīng)激的損傷程度，GSH 是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬小腸黏膜MDA 含量升高。劉靜波等研究發(fā)現(xiàn)斷奶應(yīng)激降低仔豬小腸黏膜GSH 含量。本研究表明，LPS應(yīng)激導(dǎo)致小腸黏膜MDA 水平升高，GSH 水平降低，提示LPS 誘導(dǎo)仔豬氧化應(yīng)激；日糧中添加1% 或2% Gly顯著降低了MDA 水平和增加GSH 水平，說(shuō)明Gly 緩解了LPS 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。同樣，Wang 等研究發(fā)現(xiàn)，Gly 可以抑制豬腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，維持腸道健康。Gly 是內(nèi)源性GSH 合成的底物，日糧添加Gly 可以促進(jìn)谷胱甘肽合成，提高腸道抗氧化能力。此外，Gly 可以轉(zhuǎn)化為絲氨酸發(fā)揮抗氧化作用，繼而維持腸道穩(wěn)態(tài)。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 應(yīng)激會(huì)使腸絨毛呈現(xiàn)不同程度脫落，絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度比值降低，腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，這與Zhu 等發(fā)現(xiàn)一致。腸黏膜結(jié)構(gòu)受損會(huì)導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，腸腔細(xì)菌及其產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到腸系膜淋巴結(jié)和更遠(yuǎn)的部位即細(xì)菌移位。細(xì)菌移位是評(píng)價(jià)腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)。本研究中，LPS 應(yīng)激增加脾臟、肝臟移位細(xì)菌數(shù)，而日糧中添加2% Gly 可使肝臟移位細(xì)菌數(shù)降低，腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能改善。Li 等對(duì)近交豬自體小腸移植發(fā)現(xiàn)，Gly-Gln 二肽可顯著減少肝、脾及腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌數(shù)，降低腸道通透性。Gly可為細(xì)胞合成嘌呤和嘧啶提供一碳單位，從而促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的更新及損傷修復(fù)。此外，Gly 緩解了LPS 應(yīng)激導(dǎo)致的炎性細(xì)胞（嗜中性粒細(xì)胞）浸潤(rùn)，這可能與Gly的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

應(yīng)激導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙機(jī)理還不甚清楚，一般認(rèn)為與CRF 及其受體CRFR1 信號(hào)通路激活有關(guān)。CRF 是一種由41 個(gè)氨基酸組成的下丘腦肽，是應(yīng)激和免疫/ 炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。CRF 的受體包括CRFR1 和CRFR2，CRFR2 參與腸黏膜損傷的修復(fù)，而CRFR1 則與CRF 結(jié)合激活肥大細(xì)胞。Smith 等研究表明，CRF 通過(guò)激活肥大細(xì)胞釋放類(lèi)胰蛋白酶誘導(dǎo)腸上皮屏障損傷。肥大細(xì)胞是一種造血來(lái)源的免疫細(xì)胞，可遷移到外周組織成熟并調(diào)節(jié)多種效應(yīng)功能。此外，CRF也可以促進(jìn)皮質(zhì)醇釋放，皮質(zhì)醇與腸黏膜糖皮質(zhì)激素受體（GR）結(jié)合導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙。本研究表明，LPS 應(yīng)激增加了空腸、回腸和相對(duì)mRNA 的表達(dá)及肥大細(xì)胞密度，說(shuō)明LPS 激活了CRF/CRFR1 信號(hào)通路；日糧中添加1% Gly 通過(guò)降低空腸、回腸和mRNA 的水平及肥大細(xì)胞密度來(lái)保護(hù)腸黏膜免受LPS 應(yīng)激損傷。Gly 對(duì)CRF/CRFR1 信號(hào)通路的影響未見(jiàn)報(bào)道。Ruiz-Ramírez 等研究發(fā)現(xiàn)，Gly 可以緩解大鼠氧化應(yīng)激，保護(hù)血管組織。本試驗(yàn)說(shuō)明Gly 可能通過(guò)調(diào)節(jié)CRF/CRFR1 信號(hào)通路緩解LPS 應(yīng)激導(dǎo)致的腸黏膜損傷，從而保護(hù)腸黏膜屏障功能的完整性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，斷奶仔豬日糧添加1% Gly 可以緩解LPS 應(yīng)激導(dǎo)致的CRF/CRFR1 信號(hào)通路相關(guān)基因的過(guò)量表達(dá)，降低細(xì)菌移位率及移位細(xì)菌數(shù)，提高腸道抗氧化能力，維持腸黏膜屏障功能的完整性。