牛 鵬，方 翟，劉 波，陶維昆，吳雙權(quán)，王彥平，高慶華,3*

（1.新疆塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；4.新疆法布瑞卡牧業(yè)科技有限責(zé)任公司，新疆阿拉爾 843300；5.北京奶牛中心，北京 100192）

比利時(shí)藍(lán)白花牛具有適應(yīng)性強(qiáng)、性成熟早、肌肉發(fā)達(dá)、脂肪含量少等特點(diǎn)，其明顯的雜交經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)對(duì)肉牛品種改良和生產(chǎn)力技術(shù)水平提高具有重要作用。目前，流式細(xì)胞儀分選法具有速度快、準(zhǔn)確性好、技術(shù)先進(jìn)、效果較優(yōu)等特點(diǎn)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行X、Y 精子分離，在牛上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化并得到廣泛應(yīng)用。比利時(shí)藍(lán)白花牛在我國(guó)的發(fā)展較晚，養(yǎng)殖數(shù)量少，還沒有形成成熟的生產(chǎn)體系。為滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，開展比利時(shí)藍(lán)白花牛的性別控制，能顯著提高繁殖效率和市場(chǎng)價(jià)值。目前，關(guān)于比利時(shí)藍(lán)白花牛X、Y 精子分離的研究匱乏，在國(guó)內(nèi)的報(bào)道也很少。與西門塔爾和安格斯牛不同，比利時(shí)藍(lán)白花牛鮮精死亡率和畸形率較高，在精液分選和冷凍保存過(guò)程中面臨諸多技術(shù)難點(diǎn)，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)完善。本研究以王海浪等分離西門塔爾和安格斯牛精液為基礎(chǔ)，利用流式細(xì)胞儀并優(yōu)化分選參數(shù)來(lái)分離比利時(shí)藍(lán)白花牛X、Y 精子，同時(shí)參考任忠偉等對(duì)牛精液冷凍保存技術(shù)研究來(lái)開展比利時(shí)藍(lán)白花牛冷凍精液的制備，以期在試驗(yàn)中克服技術(shù)條件上的困難，獲得高純度的性控精液并在生產(chǎn)中可以正常應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 流式細(xì)胞儀（SX-MOFLO，美國(guó)），超聲波細(xì)胞破碎儀（SYL-4005，美國(guó)），生物顯微鏡（LW3200T，上海光電公司），精子密度儀（AccuCell，法國(guó)IMV），電子冷藏盒（BC-170A，鄭州迪生電信公司），精子程序降溫儀（IMV Inc.，法國(guó)），水浴鍋（HSY-16），液氮罐（YDS-95-216）等。

1.1.2 主要試劑 熒光染料Hoechst 33342（Sigma，美國(guó)），專用稀釋液（北京奶牛中心），（改良TALP 稀釋液，分選鞘液，精子接受液，Tris-A/B 凍存液等）所用試劑無(wú)特殊說(shuō)明均為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 精液采集 在秦皇島全農(nóng)精牛育成中心選擇平均年齡4 歲的健康比利時(shí)藍(lán)白花種公牛12 頭，假陰道法采集種公牛精液（平均4.8 mL/頭），觀察精液顏色（呈乳白色或稍帶淡黃色為正常），專用稀釋液等比例稀釋，38℃下顯微鏡和精子密度儀檢測(cè)活力與密度（活力≥75%、密度為8×10～15×10/mL），電子冷藏盒（溫度為17℃）儲(chǔ)存并快速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分選前質(zhì)檢，滿足活力≥70，畸形率≤18 的精液上機(jī)分選。

1.2.2 精子染色 根據(jù)原精液密度計(jì)算相應(yīng)的Hoechst 33342 染料濃度在34℃水浴并暗室孵育45 min。加入等量含4%的卵黃的TALP 稀釋液，上下?lián)u勻后待選。

1.2.3 精子分選 設(shè)置基本分選參數(shù)，鞘液壓力50 psi，激光強(qiáng)度175 mW，按90% 以上的準(zhǔn)確率對(duì)定向正確精子分離。隨時(shí)觀察SX-MOFLO 顯示系統(tǒng)的液流、圖像、死精率等變化，以便及時(shí)調(diào)整，保證分選質(zhì)量。

1.2.4 冷凍保存 程序降溫儀將分選后的精子降溫至4℃，平衡離心處理，測(cè)定精液體積與精子濃度。經(jīng)稀釋、冷凍降溫、細(xì)管包裝，每管劑量為0.25 mL、約200 萬(wàn)精子，液氮保存。

1.2.5 精液品質(zhì)鑒定 檢測(cè)分選凍精和常規(guī)凍精，常規(guī)凍精為對(duì)照組，每組3 個(gè)重復(fù)。液氮中抽取細(xì)管凍精，38℃水浴解凍15 s。按藍(lán)群等的方法測(cè)定精液凍后存活率、活力和頂體完整率；按侯勝奎等的方法重分析測(cè)定X 和Y 精子純度。

1.2.6 頂體完整率測(cè)定 制作精子抹片，風(fēng)干后在福爾馬林磷酸鹽固定液中固定，沖洗風(fēng)干后用吉姆薩染液染色90 min，沖洗風(fēng)干后待檢。

1.2.7 個(gè)體差異對(duì)分選效果的影響 比較來(lái)自同一公牛的精液品質(zhì)對(duì)分選效果的影響（重復(fù)數(shù)為3）；比較不同公牛鮮精死亡率對(duì)分選效果的影響（選取8 頭公牛）。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS20 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 精液分選結(jié)果 對(duì)符合分選要求公牛精液分選，獲得426 管X 精液和464 管Y 精液。分選速率達(dá)到3 800～4 500 個(gè)/s，凍后活力為43%。重分析X 精子純度93.4%，Y 精子純度91.1%，部分結(jié)果見圖1 和圖2。

圖1 X 精子重分析結(jié)果

圖2 Y 精子重分析結(jié)果

2.2 精液質(zhì)量對(duì)分選效果的影響 由表1 可知，精液活力和密度均對(duì)分離速率的影響表現(xiàn)為差異顯著（<0.05），而對(duì)分離準(zhǔn)確率的影響顯著不差異。

表1 精液品質(zhì)對(duì)精子分選效果的影響

2.3 不同公牛精子分選效果的比較 由表2 可知，不同公牛個(gè)體的精液分離速率、死精率有較大差異。精液品質(zhì)越好，死精率越低，分離速率越快。雖然精液品質(zhì)會(huì)影響分離速率，但對(duì)分離準(zhǔn)確率的影響不大。因此，選擇適宜的種公牛對(duì)提高分離效率和分離精液品質(zhì)都有重要意義。

表2 不同種公牛精子分選效果比較

2.4 分選凍精與常規(guī)凍精品質(zhì)比較 由表3 可知，在對(duì)照組與X、Y 凍精組間凍后存活率、凍后活力和頂體完整率的差異皆不顯著，但常規(guī)凍精與分選凍精間的性別比例差異顯著。

表3 分選凍精和常規(guī)凍精性別比例及品質(zhì)評(píng)定

圖3 精子頂體染色圖片

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式分選和冷凍保存技術(shù)成功獲得高純度比利時(shí)藍(lán)白花牛性控精液。屬國(guó)內(nèi)首次報(bào)道使用流式細(xì)胞儀分離比利時(shí)藍(lán)白花牛X、Y 精子，為比利時(shí)藍(lán)白花牛的性別控制奠定基礎(chǔ)。

王立志利用流式細(xì)胞儀分離大連黑牛精液，X、Y 精子純度達(dá)到89%以上，建立了大連黑牛性控凍精生產(chǎn)技術(shù)流程，推廣并產(chǎn)業(yè)化示范應(yīng)用。陸陽(yáng)清利用流式細(xì)胞儀分離水牛精液，采用重分析法進(jìn)行分離純度評(píng)定，得到X 精子純度為94%，Y 精子純度為89%。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)重分析檢測(cè)X 精子純度為93.4%，Y 精子純度為91.1%，凍后活力達(dá)到43%，基本滿足低劑量人工授精要求（純度>90%，凍后活力>30%，200×10個(gè)/管）。而與Sales 等分選結(jié)果有所差異，可能是由于奶牛的精液品質(zhì)和分選指標(biāo)與肉牛不同，同時(shí)在生產(chǎn)中也有不同的價(jià)值需求。

試驗(yàn)將鞘液壓力、激光強(qiáng)度、染料濃度等分選參數(shù)已在高慶華等的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，以保證分選效率。Catt 等用Hoechst 33342 染料標(biāo)記人類精子，并將其暴露在紫外線激光下，內(nèi)源性DNA 損傷頻率未見變化。Parilla 等研究表明Hoechst 33342 對(duì)精子也沒有基因毒性影響。精子的染色過(guò)程以及激光照射的復(fù)合影響，精子在分離過(guò)程中的高倍稀釋作用以及高壓鞘液對(duì)精子膜的破壞作用等需要進(jìn)一步研究。

韋云芳等在分離精子研究中發(fā)現(xiàn)不同健康狀況和生理?xiàng)l件的雄性個(gè)體之間在不同時(shí)期、不同環(huán)境對(duì)射精品質(zhì)有明顯影響。同一雄性個(gè)體隨著環(huán)境的變化會(huì)引起相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)精液理化性質(zhì)和精漿組分等發(fā)生變化，使精子在分離過(guò)程中所需適宜條件存在差異。本實(shí)驗(yàn)在保持其他條件基本一致的前提下，研究公牛個(gè)體差異對(duì)分選效果的影響，即同一公牛精液質(zhì)量對(duì)分選效果的影響和不同公牛之間的分選效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，活力越高，密度越大，分選速率越快。由于公牛個(gè)體之間存在體況和生理?xiàng)l件的不同，隨著死精率逐漸升高，分離速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從而導(dǎo)致分選效果較差。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)流式細(xì)胞分選儀成功建立了高效的比利時(shí)藍(lán)白花牛X、Y 精子分選體系，分選后的X、Y 精子純度均達(dá)到91% 以上，凍后活力為43%，能夠滿足低劑量AI 的要求。