劉靖華 劉艷平 張秀花

小兒咳喘靈顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第四冊[1]，兒科用藥，由麻黃、生石膏、苦杏仁、瓜蔞、板藍根、金銀花和甘草組成，配方中板藍根、金銀花等具有一定的抑菌作用[2-5]，功效是潤肺清熱、止咳化痰，臨床應用廣泛。為確保臨床用藥安全，2016—2020年，山東省藥品質量風險監(jiān)測共計完成139個項目，對有關風險隱患，做到了早發(fā)現(xiàn)、早預警、早處置。2021年，本院繼續(xù)承擔小兒咳喘靈顆粒風險監(jiān)測項目。微生物限度檢查是評價藥品安全性的重要方法，微生物污染過程涵蓋生產(chǎn)、流通、儲存、使用等環(huán)節(jié)。近年來，對原輔料、包裝容器、潔凈環(huán)境、生產(chǎn)工藝等污染的 研究越來越受到重視[6-10]。本試驗首先對不同企業(yè)的樣品進行微生物限度檢查方法適用性試驗，以消除人員、環(huán)境、試劑耗材等因素對試驗結果的影響，然后根據(jù)確立的試驗方法對所有樣品進行微生物限度檢查，對結果進行統(tǒng)計分析，追溯微生物污染關口，指出存在的風險隱患，為藥品監(jiān)管工作提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子天平（HZT-A1000，福州華志科學儀器有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）、生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、細菌培養(yǎng)箱（KB240，德國BINDER）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250F-I，上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號210829；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號210620；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號210622；均由北京陸橋技術股份有限公司提供。

1.1.3 稀釋劑 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號20210624，由北京陸橋技術股份有限公司提供。

1.1.4 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]均由中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所提供，試驗所用菌株均為第4代。

1.1.5 樣品 小兒咳喘靈顆粒來源分布見表1。

表1 小兒咳喘靈顆粒來源分布

1.2 方法

1.2.1 微生物計數(shù)方法適用性試驗

1.2.1.1 菌液制備 將1.1.4項下菌種，分別劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定條件[6]培養(yǎng)、沖洗、稀釋，制成濃度為104cfu/ml的菌液備用。

1.2.1.2 供試液制備 分別取1.1.5項下樣品10 g， 加1.1.3項下稀釋劑至100 ml，混勻，制成1∶10供試液備用。

1.2.1.3 微生物計數(shù)試驗 試驗組：分別取1.2.1.1項下菌液0.1 ml與1.2.1.2項下供試液9.9 ml，混勻備用；供試品對照組：分別取1.1.3項下稀釋劑0.1 ml與1.2.1.2項下供試液9.9 ml，混勻備用；菌液對照組：分別取1.2.1.1項下菌液0.1 ml與1.1.3項下稀釋劑9.9 ml，混勻備用；以上3組分別取1 ml注入平皿中，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105[11]，加入相應的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計數(shù)，計算各試驗菌回收率。

1.2.2 控制菌檢查試驗 取1.2.1.2項下供試液10 ml至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，以大腸埃希菌為陽性對照，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為陰性對照，照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1106[12]，培養(yǎng)、選擇和分離培養(yǎng)、結果判斷。

1.2.3 結果判斷 計數(shù)方法適用性試驗中，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在0.5～2范圍內(nèi)[11]。

2 結果

2.1 微生物計數(shù)

由表2可以看出，各試驗菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，符合試驗要求，該方法可用于微生物計數(shù)檢查。

2.2 控制菌檢查

由表3可以看出，陽性對照呈陽性，陰性對照呈陰性，符合試驗要求，該方法可用于控制菌檢查。

2.3 樣品檢查

由表4可以看出，49批樣品需氧菌總數(shù)均小于103cfu/g，檢出率為30.6%，霉菌和酵母菌總數(shù)均小于102cfu/g，檢出率為20.4%，大腸埃希菌（1 g）均未檢出。

表4 49批樣品微生物限度檢查結果

3 討論

本次風險排查抽驗任務，樣品分布廣泛，生產(chǎn)環(huán)節(jié)涉及全國15家企業(yè)，經(jīng)營環(huán)節(jié)涉及全省33家企業(yè)。因原料產(chǎn)地、批次、輔料及生產(chǎn)工藝存在一定差異，不同企業(yè)的方法適用性試驗不同[13]。針對這一問題，首先采用常規(guī)法分別對15家生產(chǎn)企業(yè)的樣品進行微生物限度方法適用性試驗。從表2可以看出，15家生產(chǎn)企業(yè)微生物計數(shù)各試驗菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)；從表3可以看出，控制菌檢查陽性對照組均呈陽性，陰性對照組均呈陰性。結果表明，49批樣品均可采用常規(guī)法進行微生物限度檢查。

表2 微生物計數(shù)方法適用性試驗各試驗菌平均回收比值(n=3)

表3 控制菌檢查方法適用性試驗結果

微生物限度檢查是非無菌制劑質量控制的重要方面，也是保障制劑安全的重要措施[14]。從表4可以看出，49批樣品中需氧菌總數(shù)小于10 cfu/g共34批次，10～100 cfu/g共14批次，101～200 cfu/g共1批次，檢出率為30.6%；霉菌和酵母菌總數(shù)小于10 cfu/g共39批次，10～50 cfu/g共6批次，51～100 cfu/g共4批次，檢出率為20.4%；控制菌均未檢出。結果符合規(guī)定[15]。從檢出率來看，微生物計數(shù)的檢出率在20%～30%，說明微生物污染的概率并不高，尤其是霉菌和酵母菌。49批樣品在人、機、料、法、環(huán)等試驗條件完全一致的情況下，個別數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常，完全可以排除本實驗室對檢驗結果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，僅霉菌和酵母菌總數(shù)在90～100 cfu/g有3批，結果為臨界值，與標準限值102cfu/g相近，說明樣品污染的因素可能與原輔料產(chǎn)地、儲存條件、生產(chǎn)環(huán)境等密切相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，3批樣品涉及2家生產(chǎn)企業(yè)，且有1家生產(chǎn)企業(yè)的2批樣品為關聯(lián)批號，說明樣品污染的主要原因很可能是原輔料在購進或儲存過程中受到微生物污染?！吨腥A人民共和國藥典》2010版[16]規(guī)定，不含藥材原粉的口服給藥制劑霉菌和酵母菌數(shù)不得超過100 cfu/g，而《中華人民共和國藥典》2015版[17]及2020版[15]規(guī)定，霉菌和酵母菌總數(shù)為102cfu/g，可接受的最大菌數(shù)為200 cfu/g；從標準的修訂過程中可以看出，對微生物污染的控制越來越受重視，是確保藥品質量安全性及有效性的第一關口，相關生產(chǎn)企業(yè)須引起高度重視。同時，藥品監(jiān)督管理機構，必須嚴格按照藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范、藥品經(jīng)營質量管理規(guī)范及藥品管理法的要求，加大監(jiān)管力度，提高監(jiān)管效能，保障人民群眾安全用藥。