武 玲 曹魯娜 任穎慧 趙蕊蕊

參松養(yǎng)心膠囊收載于《中華人民共和國藥典》2020年版一部，由人參、麥冬、山茱萸、桑寄生、土鱉蟲、赤芍、黃連等中藥經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝制成，具有益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)，清心安神之功效[1]。有研究按照《中華人民共和國藥典》2005年版和2010年版要求開展參松養(yǎng)心膠囊的方法驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該樣品有明顯抑菌活性[2-3]。自《中華人民共和國藥典》2015年版起微生物計(jì)數(shù)方法在培養(yǎng)體系、檢測(cè)方法等方面做了較大修訂[4]，本研究按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1105、1106和1107要求，通過檢索文獻(xiàn)[5-7]，結(jié)合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)提 供的資料，選定敏感菌株，采用3批樣品開展獨(dú)立平行試驗(yàn)，從平皿法最低稀釋級(jí)開始進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，采用增加稀釋倍數(shù)、使用中和劑等設(shè)計(jì)方法適用性試驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器及試藥

1.1 儀器設(shè)備

BSC-1300ⅡA2生物安全柜；JE1201電子天平；DNP-9162BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱；BPH-9272精密恒溫培養(yǎng)箱；MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器等。

1.2 供試品

參松養(yǎng)心膠囊，北京以嶺藥業(yè)有限公司，批號(hào)2101017、2102023、2104009。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]，白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001]，枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，CMCC（B）63501]，大腸埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B）44102]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104]，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]，乙型副傷寒沙門菌[Salmonella paratyphi B，CMCC（B）50094]，均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇傳代并鑒定合格，本試驗(yàn)所用菌種均為第4代。

1.4 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基。氯化鈉、聚山梨酯80由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；培養(yǎng)基經(jīng)過適用性檢查，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備

2.1.1 平皿傾注法 取1.2項(xiàng)下供試品10 g，加入TSB至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液適量，加入TSB依法制成1∶50、1∶100的不同稀釋濃度供試液[8]。

2.1.2 中和法 取1.2項(xiàng)下供試品10 g，加入含7 g/L聚山梨酯80的TSB至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液。取上述供試液適量，加入含7 g/L聚山梨酯80的TSB依法制成1∶50、1∶100的供試液[8]。

2.2 菌液制備

按照《中華人民共和國藥典》2020版四部[9]通則1105的要求，制備成每毫升菌落數(shù)為5 000～10 000 cfu的試驗(yàn)菌液。

2.3 計(jì)算與結(jié)果判斷

2.3.1 計(jì)算公式

2.3.2 結(jié)果判斷 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法時(shí)，各試驗(yàn)菌回收比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)；使用中和劑時(shí)，應(yīng)確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無毒性，中和劑對(duì)照組回收比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)；3次獨(dú)立、平行試驗(yàn)中，若出現(xiàn)任一回收比值小于0.5，應(yīng)采用適宜方法重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。控制菌檢查適用性試驗(yàn)陽性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組應(yīng)無菌落生長[9]。

2.4 需氧菌總數(shù)預(yù)試驗(yàn)（選取敏感菌株）、霉菌和酵母菌總數(shù)

2.4.1 平皿傾注法 試驗(yàn)組1：取2.1.1項(xiàng)下1∶10供試液9.9 ml置入無菌試管，加入2.2項(xiàng)下枯草芽孢桿菌懸液0.1 ml，使每毫升供試液中含菌量不大于100 cfu，混勻，取上述溶液1 ml注入平皿，平行制備2個(gè)平皿。同法制備1∶50、1∶100的試驗(yàn)組，作為需氧菌總數(shù)敏感菌株預(yù)試驗(yàn)用。

試驗(yàn)組2：取2.1.1項(xiàng)下1∶10供試液9.9 ml置入無菌試管，分別加入2.2項(xiàng)下白色念珠菌和黑曲霉菌懸液各0.1 ml，其他操作同試驗(yàn)組1，作為霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)用。

供試品對(duì)照組：取2.1.1項(xiàng)下供試液9.9 ml置入無菌試管，以稀釋液代替試驗(yàn)菌液，其他操作同試驗(yàn)組1。

菌液對(duì)照組：取稀釋液9.9 ml置入無菌試管，分別加入2.2項(xiàng)下枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液各0.1 ml，其他操作同試驗(yàn)組1，作為上述3種菌株的回收試驗(yàn)用。

上述各組平皿，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]要求，注入15～20 ml溫度不超過45 ℃相對(duì)應(yīng)的SDA或TSA，測(cè)定各平皿菌落數(shù)，計(jì)算3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均回收比值。見表1。

由表1數(shù)據(jù)可知，在需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)中以枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，采用平皿傾注法（1∶100）時(shí)，回收比值仍小于0.5，表明參松養(yǎng)心膠囊對(duì)枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用；采用平皿傾注法（1∶10）時(shí)，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，表明該方法有效。

表1 需氧菌總數(shù)預(yù)試驗(yàn)、霉菌和酵母菌總數(shù)回收比值（平皿傾注法）

2.4.2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)預(yù)試驗(yàn)（中和法） 分別取2.1.2項(xiàng)下1∶10、1∶50、1∶100供試液9.9 ml，稀釋劑用含7 g/L聚山梨酯80的TSB代替TSB，加入2.2項(xiàng)下枯草芽孢桿菌懸液，其他操作同2.4.1步驟，制備試驗(yàn)組、供試品組和菌液對(duì)照組。

中和劑對(duì)照組：取含7 g/L聚山梨酯80的TSB 9.9 ml置入無菌試管，加入2.2項(xiàng)下枯草芽孢桿菌懸液，其他操作同2.4.1步驟，進(jìn)行中和劑的菌種回收試驗(yàn)。

以上各組平皿，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]要求注入15～20 ml溫度不超過45 ℃ TSA培養(yǎng)基，測(cè)定各平皿菌落數(shù)，計(jì)算3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均回收比值，結(jié)果供試液（1∶10、1∶50）加入中和劑時(shí)，枯草芽孢桿菌回收比值仍小于0.5，供試液（1∶100）加入中和劑時(shí)，回收比值在0.5～2范圍內(nèi)。

2.4.3 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)正式試驗(yàn) 取2.1.2項(xiàng)下1∶100供試液9.9 ml 5份，分別加入2.2項(xiàng)下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗(yàn)菌液各0.1 ml，其他操作同2.4.2項(xiàng)下預(yù)試驗(yàn)操作制備各組平皿。按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]要求注入15～20 ml溫度不超過45 ℃的TSA培養(yǎng)基，測(cè)定各平皿菌落數(shù)，計(jì)算3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均回收比值。

2.4.4 試驗(yàn)結(jié)果 中和劑對(duì)照組菌種回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，表明含7 g/L聚山梨酯80的TSB對(duì)試驗(yàn)菌株無抑菌性且無損傷[10]。參松養(yǎng)心膠囊采用1∶100稀釋中和法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)菌種的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，表明方法可行。見表2。

表2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)回收比值（1∶100中和法）

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.5.1 大腸埃希菌 陽性對(duì)照組：取2.1.1項(xiàng)下1∶10供試液10 ml和不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液，接種至100 ml TSB中，混勻，33 ℃培養(yǎng) 24 h。供試品組：取1∶10供試液10 ml，不加菌液，其他同陽性對(duì)照組。

2.5.2 耐膽鹽革蘭陰性菌 預(yù)培養(yǎng)：取2.1.1項(xiàng)下1∶10供試液，在23 ℃預(yù)培養(yǎng)2 h，備用。陽性對(duì)照組：分別取相當(dāng)于0.1 g、0.01 g和0.001 g的預(yù)培養(yǎng)物各2份，1份加入銅綠假單胞桿菌懸液（不大于100 cfu），1份加入大腸埃希菌懸液（不大于100 cfu），接種至10 ml EE中，33 ℃培養(yǎng)48 h。供試品組：取預(yù)培養(yǎng)物1 ml，不加菌懸液，其他同陽性對(duì)照組。

2.5.3 沙門菌 陽性對(duì)照組：取2.1.1項(xiàng)下供試品10 g和不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌懸液，接種至100 ml TSB中，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h。供試品組：取供試品10 g，不加菌懸液，其他同陽性對(duì)照組。

以上各組取稀釋劑代替供試液，其他同供試品組操作，分別制備陰性對(duì)照組。上述各組控制菌的培養(yǎng)物，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]規(guī)定進(jìn)一步選擇和分離培養(yǎng)，如果陽性對(duì)照組無菌落生長，表明參松養(yǎng)心膠囊對(duì)該菌有抑制作用，則采用增加培養(yǎng)基的方法，重復(fù)上述試驗(yàn)。

2.5.4 試驗(yàn)結(jié)果 按照常規(guī)培養(yǎng)基體積檢查時(shí)，陰性對(duì)照組均無菌落生長，大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌均檢出試驗(yàn)菌，沙門菌陽性對(duì)照組未檢出試驗(yàn)菌。表明該樣品對(duì)沙門菌有抑菌活性，將稀釋液增加至200 ml時(shí)，陽性對(duì)照組菌落生長良好。見表3。

表3 控制菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

藥品微生物限度檢查是保證用藥的有效性、保障藥品安全性的重要措施[11]。進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，首先采用平皿傾注法低稀釋倍數(shù)進(jìn)行方法學(xué)初篩，對(duì)有抑菌活性的樣品，采用適宜的方法去除其抑菌活性并進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)才能確保檢驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性[12]。

在開展方法試用性工作中以及查閱文獻(xiàn)[6,13-15]發(fā)現(xiàn)，樣品對(duì)某種試驗(yàn)菌有抑菌活性的較多，對(duì)5種試驗(yàn)菌株均有抑菌活性的較為罕見，而且對(duì)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)菌株表現(xiàn)出抑菌活性的居多。因此本研究進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，經(jīng)過綜合分析，選定枯草芽孢桿菌作為敏感菌株進(jìn)行需氧菌總數(shù)方法適用性預(yù)試驗(yàn)，減少了試驗(yàn)菌液使用量和檢驗(yàn)時(shí)的工作量，降低了試驗(yàn)過程中引入微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了工作效率，可為其他實(shí)驗(yàn)室提供借鑒。

方法適用性試驗(yàn)的本質(zhì)是建立對(duì)樣品影響更小、操作效率更高的方法[16]。2.4項(xiàng)下預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果表明參松養(yǎng)心膠囊對(duì)敏感菌株枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，采用平皿傾注法（1∶100）時(shí)3批樣品對(duì)枯草芽孢桿菌的回收比值均小于0.5，不宜繼續(xù)采用增加稀釋濃度的方法。在去除樣品抑菌活性時(shí)，薄膜過濾法較為常用，但本品供試液含不溶性顆粒較多，難以過濾，很難通過薄膜過濾法消除抑菌成分[6]。同時(shí)薄膜過濾法操作較為繁瑣，容易染菌[5]，適宜的中和劑能較好地去除樣品抑菌活性，且操作簡便，工作效率高。聚山梨酯80是一種非離子表面活性劑，可增加藥品溶解度[17-20]，對(duì)微生物有一定保護(hù)作用[21]，因此本研究使用聚山梨酯80作為中和劑。

通過試驗(yàn)，建立了參松養(yǎng)心膠囊的微生物限度檢查方法：需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用1∶100稀釋中和法；霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用平皿傾注法（1∶10）；大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查采用常規(guī)培養(yǎng)基體積，沙門菌采用培養(yǎng)基稀釋法。該方法操作簡便，能真實(shí)地反映樣品實(shí)際污染微生物情況，可為藥品生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提供參考。