賴財榮 雷 升 竇志芳* 任錫祿

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis, KOA）是一種退行性疾病，主要表現(xiàn)為多種致病因素作用下軟骨細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)合成與分解的動態(tài)平衡被打破，從而導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞增生，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙變窄，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腔積液，甚至活動障礙；在最新的風(fēng)濕協(xié)會關(guān)節(jié)炎管理指南中提到，KOA的治療以緩解癥狀、減輕病情為主要手段，主要采用非甾體抗炎藥及解熱鎮(zhèn)痛藥等緩解患者的癥狀、透明質(zhì)酸及氨基葡萄糖等藥物來減緩病情的發(fā)展[1]；在疾病的后期甚至通過手術(shù)治療KOA；長期服用西藥不僅引起一系列身體損傷，而且價格昂貴；中醫(yī)藥治療KOA有獨特的優(yōu)勢，不僅廉價、不良反應(yīng)少，療效也可以保證[2-4]。

桃仁-紅花藥對出自《醫(yī)宗金鑒》桃紅四物湯。桃仁苦以泄滯血，紅花辛散溫通，活血通經(jīng)，散瘀止痛，兩藥相須為用，一升一降，一散一收，活血祛瘀之力倍增，且有活血生新，消腫止痛之功。KOA屬于中醫(yī)“痹癥”“痹病”的范疇。桃仁、紅花藥對已廣泛應(yīng)用于KOA治療中，身痛逐瘀湯等治療KOA的經(jīng)典方劑中就包含桃仁、紅花這一藥對；但對這一藥對治療KOA的作用機制尚無系統(tǒng)闡述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一個新興學(xué)科，基于分子層面，通過數(shù)據(jù)的可視化分析，構(gòu)建藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測藥物治療疾病的作用機制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桃仁-紅花藥對治療KOA的作用機制，為中醫(yī)藥治療KOA提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 篩選“桃仁-紅花”有效成分和靶點

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP, http://tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“桃仁、紅花”為藥物名稱，分別檢索出相應(yīng)藥物的有效成分，并根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability, OB）以及類藥性（drug likeindex, DL）對其進行篩選，OB是指藥物被吸收進入人體循環(huán)的速度與程度；DL指的是化合物與已知藥物的相似性。相關(guān)研究表明，OB＞30%具有較好的口服生物利用度，DL＞0.18具有較好的類藥性[5]。本研究通過上述兩個指標(biāo)對藥物有效成分進行篩選，得到符合標(biāo)準(zhǔn)的有效成分，并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測篩選后成分的作用靶點，再把預(yù)測的靶點基因?qū)氲経niprot數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）進行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 篩選KOA相關(guān)靶點基因

在藥物作用靶點數(shù)據(jù)庫（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/），在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http://www.omim.org/）和人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）網(wǎng)站輸入“Knee osteo arthritis”為關(guān)鍵詞進行檢索，并下載相關(guān)的靶點信息，為了篩選出與疾病相關(guān)性高的靶點信息，故將GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索的疾病靶點按Relevance score＞10進行整理，再將3個數(shù)據(jù)庫得到的靶點基因合并。再導(dǎo)入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）進行基因標(biāo)準(zhǔn)化命名并刪除重復(fù)值。

1.3 藥物、疾病共同靶點的篩選及韋恩圖的構(gòu)建

將藥物相關(guān)靶點基因和疾病靶點基因?qū)氲轿⑸牛╤ttp://www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖工具構(gòu)建韋恩圖，并得到藥物與疾病的共同靶點。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物與疾病的共同靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），物種設(shè)置成“Homo sapiens”（人類），選擇高置信值0.700，刪除游離蛋白，下載TSV數(shù)據(jù)文件，再將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析，利用Cytoscape的NeteworkAnalyzer工具計算出Degree值，根據(jù)Degree值篩選出核心基因。

1.5 藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物有效成分、及藥物相關(guān)靶點基因、藥物與疾病交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)，并通過NeteworkAnalyzer工具進行分析，得到各個節(jié)點的Degree值，并根據(jù)Degree得出核心的藥物成分。

1.6 生物學(xué)功能與通路分析

將疾病與藥物的交集靶點基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org），物種選擇人類，進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P值小于0.01、最小計數(shù)為3和富集因子大于1.5。運用微生信（http: //www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖工具將P-value最小的前20條結(jié)果制作成氣泡圖進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 桃仁-紅花藥對化學(xué)成分生物口服利用度和類藥性

共獲得桃仁、紅花有效成分45個，其中桃仁有效成分23個，紅花有效成分22個。桃仁及紅花有效成分生物口服利用度和類藥性見表1。

表1 桃仁、紅花有效成分生物口服利用度和類藥性

2.2 桃仁-紅花藥對主要成分的預(yù)測靶點結(jié)果

得到桃仁相關(guān)的靶點基因252個，紅花相關(guān)靶點基因436個，其中MOL001339、MOL001343、MOL001348、MOL001350、MOL001371、MOL002680、MOL002698、MOL002706、MOL002707、MOL002719未找到相應(yīng)的靶點基因。最終得到桃仁-紅花藥對成分相關(guān)靶點基因為656個。

2.3 桃仁-紅花藥對與KOA交集靶點韋恩圖

桃仁-紅花藥對的靶點基因共得到129個，KOA的靶點基因有518個，兩者的交集靶點為43個。見圖1。

圖1 桃仁-紅花藥對與KOA交集靶點韋恩圖

2.4 藥物-疾病交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

藥物-疾病交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中有節(jié)點39個，168條邊。見圖2。前10位核心基因分別為IL6、MAPK8、IL1B、MAPK1、JUN、VEGFA、PTGS2、CCL2、EGF、MMP2。

圖2 桃仁-紅花藥對-KOA交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)340條邊，80個節(jié)點，包括疾病節(jié)點1個，藥物節(jié)點2個，基因節(jié) 點43個，桃仁成分節(jié)點18個，紅花成分節(jié)點17個。得到Degree值排前5的有效成分分別為quercetin（槲皮素）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、baicalein（黃芩素），其Degree值分別為41、30、21、20、13。見圖3。

圖3 藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.6 生物學(xué)功能與通路分析結(jié)果

結(jié)果共獲得598條GO功能條目（P＜0.01），其中包括468條生物過程，87條細(xì)胞組分，43條分子功能。生物過程主要富集在炎癥反應(yīng)（inflammatory response），對傷害的反應(yīng)（response to wounding），細(xì)胞遷移的正調(diào)控（positive regulation of cell migration），細(xì)胞運動的正調(diào)控（positive regulation of cell motility），細(xì)胞成分運動的正調(diào)控（positive regulation of cellular component movement）等。細(xì)胞組分主要富集在轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（transferase complex）、核染色體（nuclear、chromosome）、囊腔（vesicle lumen）、泛素連接酶復(fù)合物（ubiquitin ligase complex）、cullin環(huán)泛素連接酶復(fù)合物（cullin-RING ubiquitin ligase complex）等。分子功能主要富集在絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、絲氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、肽酶活性（peptidase activity）等。見圖4～6。

圖4 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的生物過程結(jié)果

圖5 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的細(xì)胞組分結(jié)果

圖6 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的分子功能結(jié)果

2.7 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

共獲得KEGG信號通路121條，刪除“cancer”相關(guān)通路，選擇P-value值最小的前20條通路。與KOA相關(guān)的通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、恰加斯?。–hagas disease）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）。見圖7。

圖7 桃仁-紅花藥對治療KOA靶點基因的KEGG信號通路

3 討論

KOA屬于中醫(yī)“痹癥”“痹病”的范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就對痹病有了較為詳細(xì)的論述，如《素問·痹論》提出：“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹”，指出了痹癥的病因病機為邪氣侵襲，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)閉阻。《類證治裁·痹癥》：“諸痹，風(fēng)寒濕三氣雜合，而犯其經(jīng)絡(luò)之陰也。風(fēng)多則引注，寒多則掣痛，濕多則重著，良久營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲， 正氣為邪氣所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹”；清代王清任的“瘀血致痹”理論中認(rèn)為瘀血不止是痹癥的產(chǎn)物，同時也是致病因素，主張活血化瘀為治療基本原則。中醫(yī)藥治療KOA歷史悠久，具有獨特的優(yōu)勢以及顯著的療效。孫壯等[6]的研究發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯聯(lián)合透化系統(tǒng)可以很好地降低相關(guān)炎癥介質(zhì)水平，抑制炎癥反應(yīng)，有效改善患者癥狀，相對于單純透化治療效果更明顯。包杭生等[7]研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可有效改善KOA患者的WOMAC評分，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液中炎癥介質(zhì)，促進骨髓水腫的吸收，延緩軟骨細(xì)胞的破壞和退變。補陽還五湯和身痛逐瘀湯都包含桃仁-紅花藥對，在治療KOA方面取得了良好的效果。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從成分、靶點、通路等角度揭示桃仁-紅花藥對治療KOA的作用機制，為中醫(yī)藥治療該疾病提供理論依據(jù)。

本研究篩選出桃仁-紅花藥對治療KOA的主要成分為槲皮素、beta-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、黃芩素等。槲皮素可以通過抑制核因子κB激活，減弱炎癥環(huán)境下軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-13產(chǎn)生，降低MMP-13/TIMP-1比例，抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞凋亡，起到保護軟骨的作用[8-9]，槲皮素也可以通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎癥介質(zhì)和金屬蛋白酶（MMP-3和MMP-9）的表達(dá)，以此改善KOA患者的癥狀[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚通過抑制細(xì)胞內(nèi)的MAPK和核因子KB通路活性，從而抑制IL-1β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞（RASF）增殖、環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達(dá)與前列腺素E2（PGE2）的產(chǎn)生，且還可抑制TNF-α在成骨細(xì)胞中誘導(dǎo)信號的傳導(dǎo)，從而減少IL-6和MCP-1的分泌，以此減輕滑膜炎癥，同時還可通過抑制C-FOS的表達(dá)，阻斷RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成[11-12]。木犀草素可降低NLRP3炎性小體活化，減少血漿內(nèi)IL-1β和IL-18水平，增強骨保護素的表達(dá)，減輕膠原激活炎癥所導(dǎo)致的骨破壞[13]。黃芩素可通過抑制因IL-1β刺激而引起的caspase-3活化，提高Bcl-2表達(dá)量和抑制PARP裂解，從而對軟骨細(xì)胞的凋亡起到保護作用，還可提高SOX-9的表達(dá)量，從而促進軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），加強兩者的相互作用，達(dá)到治療KOA的目的[14]。

將藥物-疾病交集靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，利用Cytoscape的NeteworkAnalyzer工具得出來的網(wǎng)絡(luò)前10位核心基因，分別為IL6、MAPK8、IL1B、MAPK1、JUN、VEGFA、PTGS2、CCL2、EGF、MMP2等。推測桃仁-紅花藥對治療KOA的作用機制可能與上述靶點基因密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6，IL-6可以作用于B淋巴細(xì)胞，通過分泌形式作用于軟骨細(xì)胞，抑制軟骨細(xì)胞的分裂和蛋白聚糖的合成[15]，還可以增加滑膜組織中炎癥細(xì)胞，使MMPs的表達(dá)增多，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡[16]。劉豐等[17]的研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可促進血管生成和增加血管通透性，是KOA發(fā)展過程中重要炎癥介質(zhì)，VEGF還通過影響MMPs與TIMPs，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡破壞，MMPs的增加使降解細(xì)胞外膠原和蛋白多糖的速度加快，加速了軟骨細(xì)胞的破壞[18]。CCL2屬于趨化性細(xì)胞因子，在炎癥介質(zhì)（IL-8，TNF等）刺激下，由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)[19-20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎患者血清與滑膜液中的CCL2水平與疼痛水平和殘疾程度正相關(guān)，CCL2優(yōu)先介導(dǎo)單核細(xì)胞運輸，促進了KOA的炎癥反應(yīng)與組織損傷[21]。崔冠軍等[22]的研究發(fā)現(xiàn)COX-2能夠誘導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生，PGE2能夠激活滑膜細(xì)胞中MMPs的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的降解、基質(zhì)細(xì)胞的合成和軟骨細(xì)胞的凋亡。王海英[23]的研究發(fā)現(xiàn)EGF對軟骨細(xì)胞的凋亡具有保護作用。未發(fā)現(xiàn)JUN、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1、MAPK8）與KOA的相關(guān)研究，因此可以作為新的研究方向。

通過藥物-疾病交集基因進行富集分析發(fā)現(xiàn)，靶點基因主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、恰加斯病、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥的途徑、HIF-1信號通路等信號通路。IL-17信號通路中的IL-17A和IL-17R與靶細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合，通過跨膜受體SEFIR內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子ACT1，活化后的ACT1與TRAF6相結(jié)合，最終共同激活核因子κB等炎癥通路[24]，進而導(dǎo)致了KOA癥狀的加重。TNF信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對KOA病情的發(fā)展起著重要作用，可通過促進CCL2、VEGF、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，加重機體的炎癥反應(yīng)[25]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1在炎癥條件下被激活，具有調(diào)控免疫細(xì)胞的存活以及促炎癥介質(zhì)表達(dá)功能[26]，尤其是在炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素的合成中發(fā)揮重要作用，同時HIF-1還能促進VEGF的生成，進而通過影響MMPs與TIMPs來促進軟骨細(xì)胞的凋亡[27]。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、恰加斯病、癌癥的途徑等通路未發(fā)現(xiàn)有與KOA相關(guān)研究，但不排除這些通路與KOA的關(guān)系，如需進一步了解，可作為新思路進行研究。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方式得出桃仁-紅花藥物有效成分通過多靶點，多通路產(chǎn)生抑制KOA內(nèi)的炎癥反應(yīng)、成骨細(xì)胞的表達(dá)、軟骨細(xì)胞凋亡等作用，進而達(dá)到治療KOA的目的。雖然本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)驗證了中醫(yī)藥治療KOA有效，但因過程中通過不同數(shù)據(jù)庫，不同數(shù)據(jù)庫的相關(guān)算法不相同，對該結(jié)果還需要后期試驗的驗證。