鄭景怡，孟 霞，王 智，夏金丹，謝安琪，費志剛，肖啟國

0 引言

眼表慢性炎癥是干眼、特應(yīng)性角結(jié)膜炎、瘢痕性類天皰瘡、Stevens-Johnson綜合征和眼表化學(xué)傷等諸多非感染性眼表疾病的共同病理特征及核心發(fā)病機制。長期眼表慢性炎癥不僅破壞角膜的屏障功能，促進眼表上皮細胞凋亡，進而發(fā)展為角膜上皮結(jié)膜化、眼表新生血管或鱗狀上皮化生，同時也是導(dǎo)致眼部刺激癥狀并造成視功能障礙的主要原因，因此闡明這類疾病的炎癥發(fā)生機制及調(diào)控因素具有重要的臨床意義。

胞葬作用是指吞噬細胞(主要是巨噬細胞)吞噬并清除凋亡細胞的過程。巨噬細胞作為體內(nèi)細胞因子的主要來源，成功清除凋亡細胞可以減弱炎癥因子的表達，誘導(dǎo)巨噬細胞向抑制炎癥反應(yīng)的M2型極化[1]。鐵代謝異常將導(dǎo)致組織多種病變的發(fā)生[2-3]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)眼表鐵過載可能加重眼表炎癥及組織損傷，本研究通過腹腔注射右旋糖酐鐵建立高鐵小鼠模型，繼而分別使用XMD8-92抑制和辛伐他汀增強巨噬細胞胞葬作用，探討高鐵環(huán)境下眼表炎癥的發(fā)生機制，明確胞葬作用是否通過調(diào)控巨噬細胞極化參與眼表炎癥發(fā)生。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選取50只6～8周齡健康C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量20±2g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，均在裂隙燈下排除眼表疾病。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于南華大學(xué)動物實驗中心。本研究通過南華大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.1.2主要儀器及試劑裂隙燈(卡爾蔡司有限公司)，右旋糖酐鐵(上海麥克林生化科技有限公司)，XMD8-92原粉、辛伐他汀原粉(Apexbio公司)，CD86、CD206、生長停滯特異性基因6(growth arrest specific gene 6， Gas6)、Mer酪氨酸激酶(Mer tyrosine kinase，MerTK)多克隆抗體(Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀)，IgG抗體-HRP多聚體、β-actin(Proteintech公司)，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)ELISA試劑盒(Proteintech公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立及分組采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為5組，每組10只。正常對照組，腹腔注射生理鹽水0.2mL，每3d注藥1次；單純鐵劑組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次；抑制劑組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次，第14d起每天增加1次腹腔注射50mg/kg XMD8-92(注射前0.5h將XMD8-92按小鼠體質(zhì)量比例溶于50% DMSO)0.2mL；增強劑組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次，第14d起每天增加1次腹腔注射10mg/kg辛伐他汀(注射前0.5h將辛伐他汀按小鼠體質(zhì)量比例溶于50% DMSO)0.2mL；溶劑對照組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次，第14d起每天增加1次腹腔注射50% DMSO溶劑0.2mL。

1.2.2各組小鼠相關(guān)觀察及檢測指標分別于注藥后第7、14、28d同一時間點(7p.m.)在裂隙燈下觀察各組小鼠眼前節(jié)情況并對右眼進行拍照，并參照文獻方法進行眼表炎癥指數(shù)評估[4]及角膜熒光素染色評分[5]；注藥28d后，所有實驗小鼠處死后在顯微鏡下迅速摘取右側(cè)完整眼球(帶結(jié)膜及眶周皮膚)和淚腺組織，0.9%生理鹽水沖洗去除眼球壁血跡及毛發(fā)，各組分別選取3只小鼠的右側(cè)完整眼球和淚腺組織迅速置于4%多聚甲醛溶液中，4℃保存，用于HE染色及免疫熒光染色等相關(guān)檢測；各組其余完整眼球在顯微鏡下進行角膜、結(jié)膜分離，與淚腺組織分別置于對應(yīng)EP管，-80℃保存，用于RT-PCR、Western blot、ELISA等相關(guān)檢測。

1.2.3HE染色及免疫熒光染色將完整眼球及淚腺組織固定、包埋、切片。常規(guī)HE染色，封片后顯微鏡下觀察。免疫熒光染色滴加稀釋比例為1∶50的CD86、CD206多克隆抗體過夜孵育，洗滌復(fù)溫后滴加熒光標記二抗孵育，復(fù)染封片后熒光顯微鏡下觀察(其中綠色為陽性信號，藍色為DAPI核染信號)。

1.2.4RT-PCR檢測采用Trizol試劑分別提取各組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入正向和反向引物以及SYBR后，實時定量PCR進行擴增。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)正向引物序列5’-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3’，反向引物序列5’-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3’；精氨酸酶-1 (arginase-1，Arg-1)正向引物序列5’-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3’，反向引物序列5’-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3’；內(nèi)參照β-actin正向引物序列5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’，反向引物序列5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’。通過QuantStudioTM 7系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析處理，定量檢測采用比較閾值循環(huán)(Ct)方法，β-actin作為內(nèi)參照，用相對定量方法(2-ΔΔCt)計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.5Westernblot免疫印跡分析將各組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中加入裂解液提取蛋白，制膠，取200μL蛋白，與50μL 5×Loading buffer混勻，根據(jù)蛋白定量的結(jié)果加樣，第一孔marker 2.5μL，其它每孔10μL，電泳，分別切膠Gas6(69kD)、MerTK(160kD)、β-actin(42kD)后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉后加入適當(dāng)稀釋的兔抗Gas6、MerTK(1∶1000)和鼠抗β-actin(1∶5000)過夜孵育，洗膜后加入羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(1∶6000)或羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體(1∶5000)孵育，ECL顯影，結(jié)果以目的蛋白與參照蛋白條帶比值表示各種目的蛋白的相對表達量。

1.2.6ELISA檢測將各組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織研碎后離心取上清提取蛋白，按照ELISA試劑盒步驟，酶標儀檢測各組小鼠組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達水平。加生物素標記抗體工作液(稀釋比例為1∶100)，加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(稀釋比例為1∶100)，然后每孔加入底物溶液，37℃避光顯色，用酶標儀在450nm波長處依序?qū)Ω骺坠饷芏?OD值)進行檢測。以O(shè)D值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1眼表情況及眼表炎癥指數(shù)評估正常對照組小鼠全程角膜透明，結(jié)膜未見明顯充血。注射右旋糖酐鐵后小鼠眼表炎癥反應(yīng)持續(xù)加重，注藥后第7、14d，單純鐵劑組、抑制劑組、增強劑組、溶劑對照組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；注藥后第28d，與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組眼表炎癥反應(yīng)加重明顯(P<0.05)，而增強劑組眼表炎癥反應(yīng)減輕(P<0.05)，見表1。

表1 各組注藥后不同時間點眼表炎癥指數(shù)評分 分)

2.2角膜熒光素染色正常對照組小鼠全程角膜透明，角膜熒光素染色均無染色斑點。注射右旋糖酐鐵后小鼠角膜熒光素染色評分持續(xù)上升，注藥后第7、14d，單純鐵劑組、抑制劑組、增強劑組、溶劑對照組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；注藥后第28d，與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組角膜上皮屏障功能破壞明顯加重(P<0.05)，而增強劑組角膜上皮屏障功能修復(fù)(P<0.05)，見表2。

表2 各組注藥后不同時間點角膜熒光素染色評分 分)

2.3眼表組織病理學(xué)變化注藥28d后，正常對照組小鼠角膜上皮光滑，各層結(jié)構(gòu)完整清晰且染色均勻；結(jié)膜上皮光滑連續(xù)，可見散在分布的杯狀細胞；淚腺各小葉及腺泡間細胞排列緊密，腺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均一。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組小鼠角膜上皮層細胞數(shù)量略增加，細胞排列相對雜亂，且少量扁平細胞缺失脫落，上皮欠光滑；結(jié)膜上皮完整性欠佳，細胞排列雜亂，杯狀細胞減少；淚腺各小葉及腺泡細胞排列相對雜亂，結(jié)構(gòu)欠清晰，腺泡大小欠均一。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組小鼠角膜上皮層細胞數(shù)量增多，排列雜亂不規(guī)則，扁平細胞脫落明顯；結(jié)膜上皮細胞數(shù)量增多，排列雜亂，上皮欠光滑，且杯狀細胞明顯減少甚至消失；淚腺各小葉及腺泡間細胞明顯排列雜亂不規(guī)則，結(jié)構(gòu)明顯紊亂，且腺泡大小不均一。增強劑組小鼠在角膜結(jié)構(gòu)完整性和細胞形態(tài)方面明顯改善，細胞排列較為規(guī)則，相應(yīng)損傷有所減輕；結(jié)膜中杯狀細胞增加，上皮完整性稍改善；淚腺腺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)方面明顯改善，腺泡大小較為均勻。除正常對照組外，其他各組小鼠結(jié)膜及淚腺中均可見片狀的褐色鐵沉積，見圖1。

圖1 注藥28d后HE染色觀察小鼠各眼表組織的病理學(xué)變化。

2.4眼表組織中巨噬細胞極化情況

2.4.1CD86在眼表組織中的表達注藥28d后對小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織進行CD86蛋白免疫熒光染色。正常對照組各組織中較少有CD86表達。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中免疫熒光染色均增強，即CD86蛋白表達增強。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中CD86蛋白的免疫熒光染色強度進一步增強，而增強劑組各組織中CD86蛋白表達均下調(diào)，見圖2。

圖2 注藥28d后免疫熒光染色檢測小鼠各眼表組織中CD86表達情況。

2.4.2CD206在眼表組織中的表達注藥28d后對小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織進行CD206蛋白免疫熒光染色。正常對照組小鼠各組織中均可見CD206蛋白表達。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中CD206的免疫熒光染色強度減弱，即CD206蛋白表達下調(diào)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組免疫熒光染色強度進一步減弱，即CD206蛋白表達水平進一步下調(diào)，而增強劑組各組織中CD206蛋白免疫熒光染色增強，CD206蛋白的表達相對增強，見圖3。

圖3 注藥28d后免疫熒光染色檢測小鼠各眼表組織中CD206表達情況。

2.4.3iNOS在眼表組織中的表達注藥28d后采用RT-PCR檢測小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中iNOS mRNA的表達情況。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中iNOS mRNA的表達均明顯增加(P<0.05)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中iNOS mRNA的表達均增強(P<0.05)，而增強劑組各組織中iNOS mRNA的表達均受到抑制(P<0.05)，見表3。

表3 注藥28d后小鼠各眼表組織中iNOS mRNA的表達情況

2.4.4Arg-1在眼表組織中的表達注藥28d后采用RT-PCR檢測小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中Arg-1 mRNA的表達情況。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中Arg-1 mRNA的表達均明顯下調(diào)(P<0.05)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中Arg-1 mRNA的表達均受到抑制(P<0.05)，而增強劑組各組織中Arg-1 mRNA的表達均上調(diào)(P<0.05)，見表4。

表4 注藥28d后小鼠各眼表組織中Arg-1 mRNA的表達情況

2.5眼表組織中胞葬作用情況注藥28d后采用Western blot檢測小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中Gas6、MerTK蛋白表達情況。與溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中Gas6、MerTK蛋白表達均明顯下調(diào)(P<0.05)，而增強劑組各組織中Gas6、MerTK蛋白表達均明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖4，表5。

表5 注藥28d后小鼠各眼表組織中胞葬作用相關(guān)蛋白的表達情況

圖4 注藥28d后Western blot檢測小鼠各眼表組織中Gas6和MerTK蛋白表達情況 A：角膜；B：結(jié)膜；C：淚腺。

2.6眼表組織中炎癥因子的表達注藥28d后采用ELISA檢測小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達情況。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達均明顯上調(diào)(P<0.05)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達情況均明顯上調(diào)(P<0.05)，而增強劑組各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達均明顯下調(diào)(P<0.05)，見表6～8。

表6 注藥28d后小鼠各眼表組織中IL-1β蛋白的表達情況

表7 注藥28d后小鼠各眼表組織中TNF-α蛋白的表達情況

表8 注藥28d后小鼠各眼表組織中MMP-9蛋白的表達情況

3 討論

巨噬細胞在組織器官發(fā)育、人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持、組織修復(fù)與再生中均發(fā)揮重要作用[6]。受不同的微環(huán)境影響，巨噬細胞主要極化為促進炎癥反應(yīng)發(fā)生的M1型[7]和抑制炎癥反應(yīng)并促進損傷修復(fù)的M2型[8]，在功能上相互拮抗。CD86、iNOS與CD206、Arg-1分別作為M1型與M2型巨噬細胞從精氨酸代謝途徑[9]、細胞膜蛋白的表達[10]等方面的鑒別指標。低鐵環(huán)境是保持巨噬細胞自然防御的關(guān)鍵，巨噬細胞內(nèi)鐵的含量可以影響其極化類型[11]。淚液乳鐵蛋白含量下降是干眼重要的病理生理特征之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)淚液乳鐵蛋白含量下降可導(dǎo)致眼表鐵過載，進而加重眼表炎癥及組織損傷，提示高鐵環(huán)境可以加重眼表炎癥反應(yīng)。本研究給小鼠腹腔注射高劑量右旋糖酐鐵，對眼表情況進行動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)單純鐵劑組與正常對照組小鼠比較眼表炎癥反應(yīng)加重，眼表組織中M1型巨噬細胞表達占優(yōu)勢且炎癥因子的表達增強，說明腹腔注射過量鐵劑可使機體鐵代謝失衡，誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，促進眼表炎癥發(fā)生。

胞葬作用在維持機體正常生長發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)及促進炎癥消退等方面有重要作用。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular signal regulated kinase 5，ERK5)作為絲裂原活化蛋白激酶家族的重要組成部分，在調(diào)控細胞反應(yīng)過程中起著重要作用，可被不同因素作用而介導(dǎo)細胞發(fā)生相應(yīng)變化，參與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡等多種病理表8注藥28d后小鼠各眼表組織中MMP-9蛋白的表達情況

生理過程[12]。Heo等[13]在對巨噬細胞胞葬作用抑制動脈粥樣硬化機制的研究中發(fā)現(xiàn)，ERK5的失活可通過下調(diào)胞葬作用相關(guān)信號因子如Gas6、MerTK等的表達抑制胞葬作用，并提出他汀類藥物能顯著激活巨噬細胞中ERK5及其相關(guān)信號分子，并上調(diào)胞葬作用相關(guān)信號因子的表達，增強胞葬作用。而XMD8-92作為ERK5的抑制劑可下調(diào)胞葬作用相關(guān)信號因子的表達，使巨噬細胞胞葬作用功能受損[14]。

研究表明，胞葬作用影響炎癥發(fā)生和消退，并誘導(dǎo)巨噬細胞表型和功能改變[15]。巨噬細胞吞噬功能受損可產(chǎn)生更高水平的促炎癥細胞因子，而巨噬細胞成功清除凋亡細胞可以減弱炎癥因子的表達，促進抗炎介質(zhì)白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)或轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等釋放，誘導(dǎo)M2型極化[1]。眼表上皮細胞過度凋亡不僅是眼表炎癥發(fā)病機制之一，也是眼表炎癥重要特征之一[16]，巨噬細胞通過胞葬作用持續(xù)不斷地吞噬凋亡細胞對維持眼表損傷與修復(fù)平衡、促進眼表炎癥反應(yīng)消退具有重要的積極意義。本研究通過觀察注藥后28d小鼠眼表情況發(fā)現(xiàn)，與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組眼表炎癥反應(yīng)進一步加重，眼表組織中M1型巨噬細胞表達進一步上調(diào)，同時炎癥因子的表達相應(yīng)增強，說明XMD8-92作為胞葬作用的抑制劑通過調(diào)控巨噬細胞向M1型極化促進眼表炎癥發(fā)生，加重眼表組織損傷；而與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，增強劑組眼表炎癥反應(yīng)減輕，眼表組織中M2型巨噬細胞表達占優(yōu)勢，同時炎癥因子的表達出現(xiàn)下調(diào)，說明辛伐他汀作為胞葬作用增強劑通過調(diào)控巨噬細胞向M2型極化減輕眼表炎癥反應(yīng)，促進眼表組織損傷修復(fù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射右旋糖酐鐵可成功誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，而XMD8-92作為胞葬作用的抑制劑可進一步誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化促進眼表炎癥反應(yīng)、加重眼表組織損傷，辛伐他汀作為胞葬作用的增強劑可誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化減輕眼表炎癥反應(yīng)從而有效地改善組織損傷，說明胞葬作用可通過調(diào)控巨噬細胞極化影響眼表炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究不僅證實了高鐵環(huán)境可以加重眼表炎癥反應(yīng)，而且為闡明眼表炎癥發(fā)生機制提供了新的依據(jù)。