劉巖，劉兵，李斯琪，李紅帥，徐麗斯，劉艷霞

國家老年疾病臨床研究中心 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心干二科，沈陽 110016

神經(jīng)酰胺是真核細(xì)胞中存在的一類復(fù)雜多樣的高度疏水性脂質(zhì)，它不僅是細(xì)胞膜的重要組成部分，而且作為脂質(zhì)第二信使參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過程，同時(shí)也是鞘磷脂信號(hào)途徑的重要中間產(chǎn)物[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺與多種心血管危險(xiǎn)因素關(guān)系密切，尤其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用[4-5]，測(cè)定生物樣本中各種神經(jīng)酰胺的含量，對(duì)研究神經(jīng)酰胺的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制有重要意義[6]。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)血漿中不同類型神經(jīng)酰胺含量，并探討神經(jīng)酰胺水平與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年8月1日至2020年7月31日在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院體檢或入院診治的動(dòng)脈粥樣硬化患者(AS組)114例，健康對(duì)照者(CO組)134例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡為45～55歲。頸部血管超聲測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)，并重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。以IMT>1.0 mm，定義為頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層增厚；以IMT>1.3 mm，定義為頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[7]。IMT>1.0 mm入選AS組，IMT≤1.0 mm入選CO組。資料完整且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期婦女；惡性腫瘤患者；不愿配合者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器及測(cè)定指標(biāo) 超高效液相色譜儀(美國，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，Waters)；CV100-DNA真空離心濃縮儀(中國，北京吉艾姆)。全譜神經(jīng)酰胺指標(biāo)包含：Ceramide 16∶0 (Cer 16∶0)、Ceramide 18∶0 (Cer 18∶0)、Ceramide 24∶0(Cer 24∶0)、Ceramide 24∶1(Cer 24∶1)。Cer 16∶0-d7、Cer 18∶0-d7、Cer 24∶0-d7、Cer 24∶1-d7為相應(yīng)神經(jīng)酰胺內(nèi)標(biāo)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定體重指數(shù)(BMI)、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、同型半胱氨酸等指標(biāo)，以及研究對(duì)象合并疾病、合并用藥等基線資料。研究對(duì)象均空腹采靜脈血，應(yīng)用HPLC-MS檢測(cè)血液中4種神經(jīng)酰胺(Cer 16∶0,Cer 18∶0,Cer 24∶0,Cer 24∶1)的濃度。依據(jù)檢測(cè)出的數(shù)值進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]見表1，根據(jù)總分分級(jí)，神經(jīng)酰胺低水平(0～2分)，神經(jīng)酰胺中水平(3～6分)和神經(jīng)酰胺高水平(7～12分)。

表1 UPLC-MS法檢測(cè)神經(jīng)酰胺項(xiàng)目及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(μmol/L)

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 2組研究對(duì)象的性別、年齡、BMI、三酰甘油、血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、同型半胱氨酸、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、腦梗死等患病情況，應(yīng)用口服藥物的情況等進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS組患者的總膽固醇水平、低密度脂蛋白膽固醇水平高于CO組患者，高密度脂蛋白膽固醇水平低于CO組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者一般資料比較

2.2 神經(jīng)酰胺水平比較 AS組3種神經(jīng)酰胺水平(Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 24∶1)及Cer 18∶0/24∶0均較CO組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組研究對(duì)象Cer 16∶0/24∶0、Cer 24∶1/24∶0比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 2組患者神經(jīng)酰胺水平比較[M(P25,P75)]

2.3 神經(jīng)酰胺風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)比較 按神經(jīng)酰胺水平分3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，2組低、中、高風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)所占人數(shù)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組神經(jīng)酰胺不同風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)評(píng)分人數(shù)比較[例(%)]

2.4 相關(guān)性分析 應(yīng)用二元logistic回歸分析，對(duì)2組研究對(duì)象的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平進(jìn)行校正，結(jié)果表明神經(jīng)酰胺是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[P<0.05,OR(神經(jīng)酰胺中風(fēng)險(xiǎn))=1.990，OR(神經(jīng)酰胺高風(fēng)險(xiǎn))=6.071]。見表5。

表5 動(dòng)脈粥樣硬化與神經(jīng)酰胺水平的二元logistic回歸分析

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病較常見的病因之一，也是患者死亡的主要原因之一[9]。鞘脂分子可能通過不同的機(jī)制介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。冠心病患者的神經(jīng)酰胺亞型(Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 22∶0、Cer 24∶0和Cer 24∶1)與斑塊不穩(wěn)定[10]、不良心血管事件[11]和遠(yuǎn)期預(yù)后[12]相關(guān)?；颊邉?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生受年齡、性別、血脂、肥胖等因素影響[13]。本研究中2組研究對(duì)象年齡、性別、BMI、血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、三酰甘油、同型半胱氨酸、吸煙飲酒史、并發(fā)疾病、應(yīng)用藥物等多項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

目前，神經(jīng)酰胺的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法和HPLC-MS法。其中HPLC是分離神經(jīng)酰胺的最主要技術(shù)，但前期處理復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，存在靈敏度和分辨率不高的缺陷，增加了實(shí)驗(yàn)的難度和誤差。而質(zhì)譜法，雖然靈敏度高、所需樣品少且用時(shí)較短，但由于可能出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)重疊的脂質(zhì)分子之間的相互干擾，常常導(dǎo)致其檢測(cè)特異性不佳[19-21]。本研究采用的HPLC-MS技術(shù)，是一種通過制備、分離、檢測(cè)氣相離子來鑒定化合物的專門技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中[22]。在眾多的分析測(cè)試方法中，質(zhì)譜法被認(rèn)為是一種同時(shí)具備高特異性和高靈敏度的且被廣泛應(yīng)用的方法，在臨床研究的應(yīng)用方面，質(zhì)譜已成為國際公認(rèn)的定量分析技術(shù)。HPLC-MS可以用于檢測(cè)多種神經(jīng)酰胺[23]。

本研究入選人群年齡在45～55歲，對(duì)于研究廣泛人群的神經(jīng)酰胺水平仍有一定局限性，有待于進(jìn)一步加大樣本量，并對(duì)此人群進(jìn)行隨訪，觀察未來1～3年心血管事件發(fā)生情況，進(jìn)一步研究神經(jīng)酰胺水平與動(dòng)脈硬化及心血管事件的相關(guān)性。

綜上所述，采用HPLC-MS可同時(shí)測(cè)定不同類型神經(jīng)酰胺水平，Cer 16∶0、Cer 18∶0、Cer 24∶1高水平與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)。高神經(jīng)酰胺水平與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生呈明顯正相關(guān)，是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。