張淑艷，章紹兵，陳 林，張語(yǔ)青

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

花生在我國(guó)種植面積廣闊[1]，主要分布于黃淮流域、東南沿海與長(zhǎng)江流域。近年花生的需求量不斷增加，同時(shí)產(chǎn)量也在不斷攀升?；ㄉ鞍资且环N優(yōu)質(zhì)蛋白，富含氨基酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。研究表明，由于分子結(jié)構(gòu)差異，花生蛋白的溶解性、乳化性和凝膠性等重要功能特性均無(wú)法和大豆蛋白相媲美，導(dǎo)致其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到了很大限制[3]。

近年來(lái)研究人員通過(guò)物理[4-6]、化學(xué)[7-8]以及酶[9-11]等多種方法對(duì)花生蛋白進(jìn)行改性并取得了一定進(jìn)展。其中高場(chǎng)強(qiáng)超聲處理作為一種新型非熱技術(shù)，具有快速、高效等特點(diǎn)。超聲波技術(shù)的主要原理是通過(guò)空化泡、加熱、動(dòng)態(tài)攪動(dòng)、剪切力和湍流等物理效應(yīng)作用于改性對(duì)象[12]。Zhang等[6]將花生蛋白(8 g/L)超聲處理后，發(fā)現(xiàn)亞基條帶并未改變，內(nèi)源熒光光譜與表面疏水性有所變化；黃六容等[13]超聲處理花生蛋白(0.01 g/mL)后，熒光光譜顯示蛋白分子有所展開(kāi)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量減少；張文等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理花生蛋白(6 g/L)后，花生蛋白在66.2 kDa 附近條帶增加，且在14.4 kDa處生成新條帶，α-螺旋含量降低。雖然目前針對(duì)花生蛋白已開(kāi)展了較多的超聲改性研究，但研究結(jié)論尚存在一定差異。對(duì)蛋白進(jìn)行超聲處理時(shí)，樣品濃度可能是影響改性效果的重要因素，如同樣是針對(duì)乳清蛋白進(jìn)行研究，Jambrak等[15]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)亞基超聲后發(fā)生明顯降解，而O′Sullivan等[16]卻報(bào)道亞基無(wú)變化，比較研究方法可知，他們?cè)诔曁幚砣榍宓鞍讜r(shí)樣品濃度相差了100倍。

目前在蛋白質(zhì)超聲改性研究中，通過(guò)改變超聲時(shí)間、功率和環(huán)境條件(熱、離子強(qiáng)度和pH值等)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的報(bào)道較多，但蛋白質(zhì)濃度對(duì)超聲改性效果的影響仍然未知。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，只有掌握蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理后結(jié)構(gòu)的變化，才能使其在食品加工中得到合理應(yīng)用。作者以花生蛋白為研究對(duì)象，在固定超聲處理強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，改變超聲體系中蛋白與水的質(zhì)量體積比(以下簡(jiǎn)稱(chēng)蛋白濃度)，研究花生蛋白的濃度對(duì)其分子結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生：市售。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒：合肥新恩源生物技術(shù)有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(ANS): 上海源葉生物科技有限公司 ；十二烷基硫酸鈉(SDS)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；5，5′-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸(DTNB):上海索萊寶生物科技有限公司；鹽酸胍：上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀、三氯乙酸、尿素、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、乙腈(色譜純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；G9800A 熒光分光光度計(jì)、Agilent 1260高效液相色譜: 美國(guó)安捷倫有限公司；BT-9300S激光粒度分布儀:丹東百特儀器有限公司；Tensor II傅里葉紅外光譜儀：德國(guó)Bruker公司；TSKgel GMPWXL色譜柱：日本Tokyo公司；Zeta sizer Nano ZS90納米粒度電位儀：英國(guó)馬爾文。

1.3 花生蛋白的提取

將適量花生放入粉碎機(jī)，打成花生漿，放置48 h后備用。按照m(花生漿)∶V(蒸餾水)=1∶ 6(g/mL)混合攪勻，用2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)漿液pH值為10，再將漿液于50 ℃恒溫水浴鍋中150 r/min振蕩30 min，4 000 r/min離心15 min去除上層油、乳以及沉淀得水相。調(diào)節(jié)pH值為4.5，使蛋白酸沉析出，水洗2次后4 000 r/min離心10 min得到花生蛋白(PPI)，冷凍干燥后備用。

1.4 花生蛋白的超聲處理

取適量冷凍干燥后的花生蛋白，加入蒸餾水分別配制成0.005、0.010、0.050、0.100、0.150 g/mL花生蛋白溶液，為使花生蛋白充分溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0。將探頭插入花生蛋白液面下2 cm處，冰水浴控溫，超聲功率400 W，時(shí)間5 min(工作2 s，間歇3 s)?；ㄉ鞍讟右撼曁幚砗罄鋬龈稍铮瑐溆?。對(duì)照組的花生蛋白濃度為0.010 g/mL，未經(jīng)超聲處理。

1.5 花生蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的測(cè)定

1.5.1 SDS-PAGE

采用文獻(xiàn)[17]的方法并稍加改動(dòng)。配制樣品為3 mg/mL，樣液與蛋白上樣緩沖溶液各10 μL等體積混合，沸水浴5 min，濃縮膠中電壓80 mV，分離膠中電壓120 mV。待電泳完成后考馬斯亮藍(lán)染色2 h，脫色液脫色后觀察亞基條帶情況。

1.5.2 表面疏水性的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[18]的方法并稍加改動(dòng)，用熒光探針?lè)y(cè)定樣品表面疏水性。將蛋白樣品溶解于pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，配制樣液濃度為0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL。取4 mL不同濃度蛋白樣液分別加入20 μL ANS(8 mmol/L)充分混勻。激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)480 nm下測(cè)定樣液熒光吸收強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，斜率表示該樣品的表面疏水性。

1.5.3 內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[19]的方法并稍加改動(dòng)，測(cè)定蛋白樣品內(nèi)源光譜圖。將蛋白樣品溶解于pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，稀釋蛋白至合適濃度，取適量樣液，在激發(fā)波長(zhǎng)290 nm、掃描范圍300～400 nm條件下，記錄最大發(fā)射波長(zhǎng)(λmax)。

1.5.4 暴露游離巰基與二硫鍵的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[20]的方法并稍加改動(dòng)，將蛋白樣品溶解于Tris-Gly 緩沖溶液，充分溶解后5 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白濃度。向3 mL的上清液中加入50 μL 4 mg/mL DTNB溶液，混勻后室溫放置1 h，以緩沖溶液為空白對(duì)照，在412 nm處測(cè)定吸光度。暴露游離巰基含量按照公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：A412為吸光度；C為樣品蛋白濃度，mg/mL。

采用文獻(xiàn)[21]的方法并稍加改動(dòng)，30 mg蛋白樣品加入4.7 g鹽酸胍，用Tris-Gly 緩沖溶液定容至10 mL。取1 mL樣液加入4 mL脲-鹽酸胍溶液和50 μL Ellman試劑，412 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(2)計(jì)算游離巰基含量。

(2)

式中：D為稀釋倍數(shù)。

取1 mL樣液加入50 μLβ-巰基乙醇和4 mL脲-鹽酸胍溶液，25 ℃放置1 h，加入10 mL 12%的三氯乙酸，25 ℃放置1 h，5 000 r/min離心15 min，將沉淀用12%三氯乙酸洗滌2次后溶于5 mL的8 mol/L尿素中，待沉淀完全溶解加入40 μL Ellman試劑，412 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(2)計(jì)算出總巰基含量，根據(jù)公式(3)計(jì)算二硫鍵含量。

(3)

1.5.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)采用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定。充分烘干的溴化鉀與蛋白樣品按照質(zhì)量比100∶ 1充分研磨混勻壓片，掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1。測(cè)定結(jié)果采用Peak Fit 4.12軟件進(jìn)行分析處理。

1.5.6 粒徑的測(cè)定

采用納米粒度電位儀測(cè)定可溶性蛋白樣品粒徑。將蛋白樣品溶解于pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，充分溶解后5 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)法)，稀釋上清液至合適濃度，取1.2 mL樣液于粒徑儀測(cè)定。由儀器自帶軟件處理后可得出花生蛋白平均粒徑和多分散性指數(shù)(polydispersity index，PDI)。

1.5.7 花生蛋白分子量的分布測(cè)定

選用TSKgel GMPWXL柱子對(duì)蛋白樣品進(jìn)行HPLC分離。流動(dòng)相采用V(0.1 mol/L 磷酸緩沖液+0.1 mol/L 硫酸鈉)∶V(乙腈)=8∶ 2。測(cè)定前，所有蛋白質(zhì)樣品均通過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為20 μL，采樣時(shí)間60 min，蛋白質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)2次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan方差分析(P<0.05)，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲處理下不同蛋白濃度對(duì)花生蛋白亞基組成的影響

目前有關(guān)花生蛋白亞基組成在超聲處理前后變化的研究結(jié)論并不一致，研究者使用的花生蛋白濃度也各不相同。由圖1可知，與對(duì)照組的花生蛋白相比，超聲處理下各濃度的花生蛋白并沒(méi)有產(chǎn)生新的亞基條帶，同時(shí)也沒(méi)有亞基條帶的消失(在更高超聲強(qiáng)度下處理也是如此，結(jié)果未展示)。可見(jiàn)，超聲處理下無(wú)論體系中蛋白濃度如何變化，均不能使花生蛋白分子酰胺鍵斷裂，這與Zhang等[6]的研究結(jié)論一致。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白；1為對(duì)照組花生蛋白；2—6為400 W 超聲處理5 min的花生蛋白(蛋白濃度分別為0.005、0.010、 0.050、0.100、0.150 g/mL)。圖1 不同濃度花生蛋白超聲處理后的亞基組成Fig.1 Subunit composition of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

2.2 超聲處理下不同蛋白濃度對(duì)花生蛋白表面疏水性和內(nèi)源熒光光譜的影響

如圖2所示，超聲處理后的花生蛋白表面疏水性明顯改變。與對(duì)照組花生蛋白相比，400 W條件下低濃度蛋白(0.005、0.010、0.050 g/mL)超聲處理5 min后表面疏水性略有增加；而0.100 g/mL的花生蛋白經(jīng)同等超聲強(qiáng)度處理后，表面疏水性顯著增加；隨著花生蛋白濃度的增大，蛋白表面疏水性反而下降。此外，與對(duì)照組花生蛋白的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)(329 nm)相比，不同濃度的花生蛋白經(jīng)超聲處理后，只有0.100 g/mL花生蛋白的λmax(331 nm)發(fā)生了明顯紅移。超聲波的作用機(jī)理主要是空穴效應(yīng)，在超聲過(guò)程中空化泡不斷炸裂并循環(huán)往復(fù)。導(dǎo)致低濃度時(shí)蛋白表面疏水性和λmax改變不明顯的原因可能是：此時(shí)的低濃度蛋白體系不適合產(chǎn)生強(qiáng)烈的空穴效應(yīng)；即使空穴效應(yīng)強(qiáng)烈，但體系中蛋白分子數(shù)量較少時(shí)對(duì)空穴效應(yīng)有逃避的可能。而當(dāng)?shù)鞍诐舛冗^(guò)高時(shí)(如0.150 g/mL)，體系黏度也隨之顯著增加，會(huì)影響空化泡的形成，此時(shí)同樣不利于蛋白質(zhì)的改性。說(shuō)明在過(guò)低或過(guò)高的蛋白濃度下，超聲波不會(huì)顯著改變花生蛋白的表面疏水性和內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3、圖4同。圖2 不同濃度花生蛋白超聲處理后的 表面疏水性和內(nèi)源熒光發(fā)射波長(zhǎng)Fig.2 Surface hydrophobicity and endogenous fluorescence emission wavelengths of peanut protein with different concentrations treated by ultrasound

圖3 不同濃度花生蛋白超聲處理后的暴露游離 巰基與二硫鍵含量Fig.3 Content of exposed free sulfhydryl groups and disulfide bonds after ultrasonic treatment of peanut protein with different concentrations

2.3 超聲處理下不同蛋白濃度對(duì)花生蛋白暴露游離巰基與二硫鍵含量的影響

暴露游離巰基的含量可以反映蛋白結(jié)構(gòu)的變化。如圖3所示，同等強(qiáng)度超聲處理后，與對(duì)照組花生蛋白相比，各個(gè)濃度超聲處理后花生蛋白的暴露游離巰基含量均顯著增加，應(yīng)該是蛋白分子展開(kāi)所致，這與李俠等[22-23]對(duì)花生蛋白超聲處理的研究結(jié)果一致。蛋白濃度0.005～0.100 g/mL時(shí)，超聲處理后暴露游離巰基含量逐漸增大，在0.100 g/mL時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)濃度增大到0.150 g/mL時(shí)，暴露游離巰基含量有所下降，這與表面疏水性的改變趨勢(shì)一致，進(jìn)一步說(shuō)明在蛋白濃度0.100 g/mL進(jìn)行超聲處理時(shí)，花生蛋白分子的展開(kāi)程度最高。

對(duì)于蛋白質(zhì)而言，半胱氨酸殘基中的巰基可以與二硫鍵相互轉(zhuǎn)化。蛋白分子可以通過(guò)二硫鍵連接形成更大的蛋白聚集體。如圖3所示，同等強(qiáng)度超聲處理后，與對(duì)照組花生蛋白相比，各個(gè)濃度超聲處理后花生蛋白的二硫鍵數(shù)量都有所增加，其中以0.010 g/mL的花生蛋白超聲處理后二硫鍵含量增加最為顯著。說(shuō)明超聲促使蛋白表面游離巰基含量增加后，這些游離巰基之間還發(fā)生了部分交聯(lián)。

2.4 超聲處理下不同蛋白濃度對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，一般認(rèn)為：β-折疊(1 600～1 640 cm-1)，無(wú)規(guī)則卷曲(1 640～1 650 cm-1)，α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)，β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 700 cm-1)[24]。由表1所得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布可知，不同濃度花生蛋白經(jīng)超聲處理后與對(duì)照組花生蛋白相比，α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲含量不存在顯著性差異，但0.010 g/mL蛋白濃度處理時(shí)β-折疊含量顯著下降，β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加。說(shuō)明該蛋白濃度下超聲破壞了部分β-折疊片中的氫鍵，促使其多肽鏈反轉(zhuǎn)180°形成了β-轉(zhuǎn)角[25]?？傮w來(lái)說(shuō)，花生蛋白在超聲后二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較小，這可能與超聲強(qiáng)度較弱有關(guān)。

表1 不同濃度花生蛋白超聲處理后的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布Table 1 Secondary structure distribution of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

2.5 超聲處理下不同蛋白濃度對(duì)花生蛋白粒徑的影響

圖4 不同濃度花生蛋白超聲 處理后的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

由圖4可知，對(duì)照組蛋白和0.005 g/mL超聲處理的可溶性蛋白粒徑分布相對(duì)集中，主要呈現(xiàn)1個(gè)大峰，而超聲處理下其他濃度的蛋白粒徑分布主要呈現(xiàn)2個(gè)大峰。由表2可知，對(duì)照組花生蛋白分子的平均粒徑164.47 nm，經(jīng)過(guò)超聲處理后，各個(gè)濃度的花生蛋白的平均粒徑均顯著增大，在花生蛋白濃度0.100 g/mL時(shí)，超聲處理后的蛋白粒徑達(dá)到263.23 nm，可能原因是此時(shí)蛋白分子充分展開(kāi)后暴露出更多的疏水基團(tuán)(圖2)，分子間疏水相互作用增強(qiáng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集，平均粒徑隨之增加。PDI可以反映所測(cè)定樣品體系中粒徑的分布情況，數(shù)值越小代表該樣品分布比較均勻。0.005 g/mL花生蛋白經(jīng)過(guò)超聲處理后PDI最小，說(shuō)明該濃度下蛋白超聲后粒徑分布最均勻。值得注意的是，目前也有關(guān)于蛋白質(zhì)在超聲后粒徑減小的研究報(bào)道[26-27]，這很有可能與研究者采用的超聲強(qiáng)度不同有關(guān)。嘗試在更高超聲強(qiáng)度下(500 W，5 min)處理花生蛋白，發(fā)現(xiàn)其平均粒徑減小，這說(shuō)明高超聲強(qiáng)度雖然不會(huì)使蛋白亞基發(fā)生降解，但可能會(huì)通過(guò)破壞亞基間疏水相互作用導(dǎo)致其相互離解。

表2 不同濃度花生蛋白超聲處理后的平均 粒徑與PDITable 2 Average particle size and PDI of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

2.6 超聲處理下不同蛋白濃度對(duì)花生蛋白分子量分布的影響

如圖5所示，根據(jù)分子排阻高效液相色譜測(cè)定，對(duì)照組花生蛋白按分子量不同分為P1、P2和P3三大類(lèi)組分，不同濃度的蛋白超聲處理后主要組分的出峰時(shí)間明顯前移，表明有更大分子量的新組分(可溶性蛋白聚集體)生成，這也和蛋白粒徑分布測(cè)定的結(jié)果(圖4)相互印證，說(shuō)明適當(dāng)強(qiáng)度的超聲處理可以促使花生蛋白發(fā)生聚集，分子量增加，與Jiang等[28]的報(bào)道一致。由于樣品在測(cè)定前通過(guò)了0.45 μm膜過(guò)濾，一些具有更大粒徑(如超過(guò)500 nm)的蛋白聚集體在液相色譜圖上得不到體現(xiàn)。不同濃度的蛋白色譜圖之間差異并不大，但對(duì)0.005 g/mL蛋白進(jìn)行超聲處理時(shí)，蛋白分子量的增加幅度略小。此外，花生蛋白經(jīng)超聲處理后出現(xiàn)了少量更低分子量的組分，說(shuō)明在此超聲強(qiáng)度作用下，雖然蛋白亞基聚集的現(xiàn)象更加明顯，但同時(shí)也會(huì)有少量亞基從原有蛋白寡聚體中發(fā)生解離。因此，可以推斷花生蛋白在超聲作用下亞基的聚集和解離現(xiàn)象同時(shí)存在，究竟以哪種現(xiàn)象為主則與超聲強(qiáng)度有關(guān)。

圖5 不同濃度花生蛋白超聲處理后的 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

3 結(jié)論

在本研究的超聲體系中，無(wú)論蛋白濃度高低，都不能使花生蛋白亞基發(fā)生降解，然而蛋白濃度對(duì)其他結(jié)構(gòu)特性(表面疏水性、內(nèi)源熒光光譜、暴露游離巰基含量和二級(jí)結(jié)構(gòu))有顯著影響。在低超聲強(qiáng)度下各個(gè)濃度花生蛋白的平均粒徑均顯著增大，在高超聲強(qiáng)度下平均粒徑則顯著減小。在超聲過(guò)程中蛋白分子聚集和亞基解離現(xiàn)象同時(shí)存在，低強(qiáng)度超聲主要引起分子聚集(可能通過(guò)暴露的活性基團(tuán)相互作用)，高強(qiáng)度超聲主要引起亞基解離(可能通過(guò)破壞分子內(nèi)/間的非共價(jià)作用力)。已有關(guān)于蛋白超聲改性的研究選用的蛋白濃度較低，本研究發(fā)現(xiàn)一定超聲強(qiáng)度下，蛋白濃度會(huì)顯著影響超聲改性效果，因此，為達(dá)到蛋白分子結(jié)構(gòu)特性的預(yù)期改性目標(biāo)，超聲時(shí)選擇合適的蛋白濃度十分重要。