張雪 蘭東 寧淑華 于思思

[摘要]目的：探討A型肉毒毒素（BTXA）通過TGF-β1/Smad通路對增生性瘢痕成纖維細胞抑制作用及其機制。方法：體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細胞，采用0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA處理成纖維細胞，分別作為0.2 U/ml BTXA組、0.4 U/ml BTXA組、0.8 U/ml BTXA組，空白對照組不采用BTXA（0 U/ml）處理，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組用0.8 U/ml BTXA和10 ng/ml的TGF-β1激活劑處理。甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測細胞活力;流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期;蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞周期蛋白（CyclinD1）、增殖細胞核抗原（PCNA）、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達。結果：與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/mlBTXA顯著降低增生性瘢痕成纖維細胞活力和PCNA蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著提高增生性瘢痕成纖維細胞凋亡率（P<0.05）。與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著升高增生性瘢痕成纖維細胞G0/G1期（P<0.05）;顯著降低細胞S期、G2/M期和Cyclin D1蛋白表達（P<0.05）。與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著降低p-Smad2/3蛋白表達（P<0.05）。與0.8 U/ml BTXA組比較，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組顯著升高增生性瘢痕成纖維細胞活力、S期、G2/M期和Cyclin D1、PCNA蛋白表達（P<0.05）;顯著降低細胞凋亡率和細胞G0/G1期（P<0.05）。結論：BTXA通過抑制TGF-β1/Smad通路從而抑制增生性瘢痕成纖維細胞存活，為臨床治療提供了思路。

[關鍵詞]A型肉毒毒素（BTXA）;TGF-β1/Smad通路;增生性瘢痕;機制

[中圖分類號]R334+.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）05-0093-04

To Explore the Inhibitory Effect of Type A Botulinum Toxin on Hypertrophic Scar Based on TGF-β1/Smad Pathway

ZHANG Xue，LAN Dong，NING Shuhua，YU Sisi

（Department of Dermatology and Plastic Surgery，Beijing Chao-Yang Hospital，Capital Medical University，Beijing 100043，China）

Abstract： Objective To investigate the inhibitory effect of botulinum toxin type A （BTXA） on hypertrophic scar fibroblasts and its mechanism through TGF-β1/Smad pathway. Methods The hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro， and the fibroblasts were treated with 0.2， 0.4， and 0.8 U/ml BTXA， respectively， as the 0.2 U/ml BTXA group， 0.4 U/ml BTXA group， and 0.8 U/ml BTXA group. The blank control group was not treated with BTXA （0 U/ml）. The 0.8 U/ml BTXA+TGF-β1 group was treated with 0.8 U/ml BTXA and 10 ng/ml of TGF-β1 activator. Methylthiazolyltetrazole （MTT） method was used to detect cell viability; flow cytometry was used to detect cell apoptosis and cell cycle; Western blot was used to detect cell cycle protein （CyclinD1）， proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， Smad2/ 3. p-Smad2/3 protein expression. Results Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly reduced the viability of hypertrophic scar fibroblasts and the expression of PCNA protein （P<0.05）. Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly increased the apoptosis rate of hypertrophic scar fibroblasts （P<0.05）. Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly increased the G0/G1 phase of hypertrophic scar fibroblasts （P<0.05）; significantly reduced the cell S phase， G2/M phase and Cyclin D1 protein expression （P<0.05）. Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly reduced the expression of p-Smad2/3 protein （P<0.05）. Compared with 0.8 U/ml BTXA group， 0.8 U/ml BTXA+TGF-β1 group significantly increased the viability of hypertrophic scar fibroblasts， S phase， G2/M phase and Cyclin D1， PCNA protein expression （P<0.05）， significantly reduce the rate of cell apoptosis and cell G0/G1 phase （P<0.05）. Conclusion BTXA inhibits the survival of hypertrophic scar fibroblasts by inhibiting the TGF-β1/Smad pathway.

Key words： BTXA; TGF-β1/Smad pathway; hypertrophic scar; mechanism

瘢痕是創(chuàng)傷愈合留下的痕跡，在一些個體中，修復過程發(fā)生異?？梢詫е陆M織過度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕的形狀不規(guī)則，突出皮面，高低不平[1-2]。臨床表現為淡紅色、暗紅色或褐色，有強烈的瘙癢感，有壓痛。瘢痕邊緣和正常皮膚之間有明顯界限，邊緣呈現圓滑的苔形，無浸潤性生長[3-4]。A型肉毒毒素（BTXA）是一種神經毒性藥物，在美容外科領域已廣泛應用，具有萎縮、軟化瘢痕的作用[5]。BTXA治療機體瘢痕增生臨床療效佳，不良反應少，具有廣闊的臨床應用前景[6]。TGF-β1是目前已知與瘢痕纖維化關系最密切的一種細胞因子[7]。Smads蛋白家族是近年來發(fā)現的TGF-β受體下游信號蛋白，它將TGF-β受體激活后的信號從胞漿傳遞到細胞核內，作用于相應的靶基因，從而發(fā)揮作用[8]。本研究主要探討B(tài)TXA對增生性瘢痕成纖維細胞的抑制作用，并進一步分析其抑制機制與TGF-β1/Smad通路的相關性。

1? 材料和方法

1.1 材料及來源：BTXA（購于蘭州生物制品研究所）;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（購自美國Sigma公司）;胰蛋白酶（購自上?？道噬锟萍加邢薰荆?TGF-β1/Smad通路激活劑（購自美國Gibco公司）;甲基噻唑基四唑（MTT）（購自美國Epitmics公司）;BCA蛋白檢測試劑盒（購自北京賽因百奧生物技術有限公司）;細胞周期蛋白（Cyclin D1）、增殖細胞核抗原（PCNA）、Smad2/3、p-Smad2/3（購自上海碧云天生物科技有限公司）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（購自北京百奧萊博科技有限公司）。

1.2 瘢痕組織：收集2017年9月-2019年11月在筆者醫(yī)院進行手術的臨床燒傷后瘢痕整形手術患者30例，其中男14例，女16例，年齡15～60歲，病程3個月～2年。術中切除瘢痕組織，瘢痕組織處于增生期，且患者均無用藥史。本研究經醫(yī)院倫理醫(yī)學委員會同意，患者知情并自愿簽署同意書。

1.3 方法

1.3.1 增生性瘢痕成纖維細胞的制備[9]：將手術中獲得的增生性瘢痕組織，置于無菌操作臺中，用手術剪將皮下組織徹底去除，保留帶表皮的瘢痕組織，并將瘢痕組織切成1 mm×1 mm的小組織塊，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后，加入0.25 g/L的II型中性酶，4 ℃過夜后，再加入3倍體積的2%的I型膠原酶，37 ℃培養(yǎng)2 h，即可獲得單細胞懸液。1 500 r/min離心10 min，并將離心后的細胞溶解于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。7 d后首次換液，往后每隔3 d換液1次，大約15 d細胞基本融合成片，以1：2的比例進行傳代，實驗取2～4代。

1.3.2 實驗分組：將用上述方法正常培養(yǎng)且不采用BTXA（0 U/ml）處理的成纖維細胞作為空白對照組;將采用0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA處理48 h的成纖維細胞分別作為0.2 U/ml BTXA組、0.4 U/ml BTXA組、0.8 U/ml BTXA組。為探究TGF-β1/Smad通路的作用，將10 ng/ml的TGF-β1激活劑與0.8 U/ml BTXA在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24 h，記作0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組。

1.3.3 MTT法檢測細胞活力：收集各組細胞接種至96孔板（5×103個/孔），每孔加入20 μl MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處的相對吸光度值（OD），計算細胞存活率。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期：取各組細胞，預冷PBS洗滌，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl FITC與5 μl PI，室溫振蕩孵育10 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。取各組細胞（1×106個/毫升），0.25%胰蛋白酶消化，加入預冷PBS（500 μl）重懸細胞，再加入3.5 ml預冷70%乙醇，充分混勻，置于4 ℃條件下孵育24 h，離心后棄上清，PBS洗滌，棄上清，向細胞沉淀中加入RNaseA（50 μl），水浴30 min（37 ℃），加入PI染色液（450 μl），4 ℃孵育30 min，應用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.5 Western blot檢測Cyclin D1、PCNA、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達：提取各組細胞總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量，各組蛋白上樣量60 μg，SDS-PAGE后，經電轉將蛋白轉移至PVDF上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的一抗（1：1 000），4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min;再加入二抗（1：2 000）室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，定影，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞活力的影響：與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組的增生性瘢痕成纖維細胞活力和PCNA蛋白表達均顯著降低，且BTXA濃度與增生性瘢痕成纖維細胞活力和PCNA蛋白表達均呈反變關系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1、圖1。

2.2 BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞凋亡率的影響：與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組的增生性瘢痕成纖維細胞凋亡率均顯著增加，且隨著BTXA濃度的增加，凋亡率也呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖2。

2.3 BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞周期的影響：與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組增生性瘢痕成纖維細胞G0/G1期顯著拉長，且BTXA濃度與細胞G0/G1期呈正比關系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;顯著降低細胞S期、G2/M期和Cyclin D1蛋白表達，且BTXA濃度與細胞S期、G2/M期和Cyclin D1蛋白表達均呈反變關系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3、圖3。

2.4 BTXA對增生性瘢痕成纖維細胞TGF-β1/Smad通路的影響：與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組p-Smad2/3蛋白表達均顯著降低，且BTXA濃度與p-Smad2/3蛋白表達呈反變關系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4、圖4。

2.5 激活TGF-β1/Smad通路對BTXA處理的增生性瘢痕成纖維細胞活力、凋亡率和細胞周期的影響：與0.8 U/ml BTXA組比較，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組增生性瘢痕成纖維細胞活力、S期、G2/M期和Cyclin D1、PCNA蛋白表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而細胞凋亡率和細胞G0/G1期均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表5、圖5。

3? 討論

增生性瘢痕是以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的皮膚膠原性疾病。臨床上針對該疾病有很多的方法治療，目前越來越多的注射類藥物在增生性瘢痕的治療中起到了重要作用[10]。BTXA是一種神經毒性藥物，它是肉毒梭菌在生長繁殖過程中產生的一種細菌外毒素，其重鏈可與運動神經終板上的乙酰膽堿受體高親和力結合，毒素通過受體介導的胞飲作用進入細胞內[11]。近期的研究結果顯示，BTXA能有效抑制增生性瘢痕體積，使皮膚表面組織變軟、產生松弛，改變攣縮程度改變[12]。

本研究表明，與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著降低增生性瘢痕成纖維細胞活力和細胞周期;顯著提高增生性瘢痕成纖維細胞凋亡率。周海洋等[13]研究表明，BTXA可有效改善增生性瘢痕的情況，且具有一定安全性。武鳳蓮等[14]研究表明，BTXA可抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖，并促進凋亡，具有劑量和時間依賴性。張雪等[15]研究表明，BTXA呈計量依賴性明顯抑制增生性瘢痕成纖維細胞活力和細胞周期，并促進細胞凋亡。陶諫等[16]研究表明，注射BTXA可以降低瘢痕增生的程度從而改善額部傷口縫合后的美容效果。宋黎等[17]研究表明，BTXA注射可有效性及安全性的預防面部創(chuàng)傷或術后增生性瘢痕。劉斌等[18]研究表明，BTXA治療瘢痕增生的療效和安全性具有非常重要的臨床意義。

本實驗研究發(fā)現，與空白對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著降低p-Smad2/3蛋白表達。劉昌玲等[19]研究發(fā)現，在增生性瘢痕成纖維細胞中，Smurf2通過泛素化降解Smad7，削弱了Smad7對TGF-β1信號轉導的抑制作用，從而增強了TGF-β1/Smad信號轉導，參與了增生性瘢痕的形成。熊維等[20]研究發(fā)現，TGF-β1/Smad信號轉導通路是增生性瘢痕關鍵通路，Smad是治療增生性瘢痕的生物靶點之一。

本實驗發(fā)現，與0.8 U/ml BTXA組比較，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組顯著升高增生性瘢痕成纖維細胞活力、S期、G2/M期和CyclinD1、PCNA蛋白表達;顯著降低細胞凋亡率和細胞G0/G1期。說明，BTXA通過抑制TGF-β1/Smad通路可抑制增生性瘢痕成纖維細胞增殖。尚念勝等[21]研究發(fā)現，BTXA通過TGF-β1/Smad通路和ERK通路表達抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲和血管形成，并減少膠原蛋白積累。有類似的研究發(fā)現，青川復合物通過TGF-β1/Smad蛋白信號傳導通路對人增生性瘢痕成纖維細胞發(fā)揮作用[22]。山豆根醇提取物干預TGF-β1/Smad通路抑制兔耳增生性瘢痕[23]。

綜上所述，BTXA通過抑制TGF-β1/Smad通路從而抑制增生性瘢痕成纖維細胞存活，具有廣闊的臨床應用前景。

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[收稿日期]2020-01-18

本文引用格式：張雪，蘭東，寧淑華，等.基于TGF-β1/Smad通路探討A型肉毒毒素對增生性瘢痕的抑制作用及機制[J].中國美容醫(yī)學，2021，31（5）：93-97.