史敏 丁欣強 郭曉波 陳煒熒 張明雨

[摘要]目的：分析燒傷組織中miR-506-3p的表達及其對自噬水平的調(diào)控。方法：提取正常皮膚組織、燒傷皮膚組織和熱處理成纖維細(xì)胞細(xì)胞的總RNA，采用熒光定量RT-qPCR、Western Blot分別檢測各細(xì)胞miR-506-3p和自噬相關(guān)因子（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、p62及CollagenⅠ）表達水平;采用同樣方法檢測miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到真皮成纖維細(xì)胞中對上述自噬相關(guān)因子表達水平的影響，并利用CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖效率。結(jié)果：與正常組織相比，燒傷組織和熱處理成纖維細(xì)胞中，miR-506-3p的表達下調(diào)，自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及Collagen Ⅰ的表達顯著上調(diào)（P<0.01），而p62表達下調(diào)（P<0.05）;miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到皮膚成纖維細(xì)胞中，miR-506-3p表達顯著降低，促進了細(xì)胞增殖和自噬發(fā)生，而miR-506-3p的過表達則顯示出相反的作用（P<0.05）。結(jié)論：miR-506-3p在燒傷皮膚組織恢復(fù)中發(fā)揮著積極作用，對調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的自噬水平具有重要作用，有可能成為燒傷愈合后瘢痕潛在治療的靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]熱損傷;真皮成纖維細(xì)胞;微小RNA;自噬;瘢痕形成

[中圖分類號]R334+.5? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）05-0086-04

Expression of MiR-506-3p and Autophagy-related Factors in Post-burn Skin Fibroblasts

SHI Min1，DING Xinqiang2，GUO Xiaobo3，CHEN Weiying1，ZHANG Mingyu1

（1.School of Medicine，Xi’an Peihua University，Xi’an 710125，Shaanxi，China; 2.Department of Dermatology，Xi'an Children's Hospital，Xi’an 710003，Shaanxi，China; 3.Clinical Laboratory，Xi’an Central Hospital，Xi’an 710003，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To analyze the expression of miR-506-3p in post-burn tissues and its regulation of autophagy. Methods To extract the total RNA of normal skin tissue， burned tissue and heat treatment into fibroblast cells， using fluorescent quantitative RT-QPCR， Western Blot， respectively， detects mIR-506-3p and autophagy-related factors（LC3-II/I ratio， Atg5， p62 and Collagen I） in post-burn tissue and heat-damaged skin fibroblasts， RT-qPCR was also used to detect the effect of miR-506-3p mimic or miR-506-3p inhibitor transfected into dermal fibroblasts on the expression of autophagy-related factors， and CCK-8 method was used to detect the proliferation efficiency of transfected cells. Results Compared with normal tissues， in post-burn tissues and heat-treated fibroblasts， the expression of miR-506-3p was down-regulated， and the expression of autophagy-related factors， such as LC3-II/I ratio， Atg5 and Collagen I， were significantly up-regulated， while the expression of p62 was down-regulated. When miR-506-3p inhibitors were transfected into dermal fibroblasts， the expression of miR-506-3p was significantly down-regulated， which could promote cell proliferation and autophagy， while the overexpression of miR-506-3p showed the opposite effect. Conclusion MiR-506-3p plays an positive role in the recovery of post-burn skin， and plays an important role in regulating the autophagy level of fibroblasts，it may be a potential target for post-burn scar treatment.

Key words： thermal damage; dermal fibroblasts; micro-RNA; autophagy; scar formation

皮膚在燒傷后的修復(fù)過程中有多種類型的細(xì)胞參與，其中最重要的是真皮成纖維細(xì)胞，其通過分泌多種細(xì)胞因子促進細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[1]，其中微小RNA（miRNA）參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)并影響著人增生性瘢痕的形成[2]。此外，研究表明自噬與病理性瘢痕等纖維化疾病密切相關(guān)，miRNA在多個自噬通路中扮演著關(guān)鍵角色，如在腎臟缺血再灌注損傷時miR-21可抑制細(xì)胞自噬，促進腎臟纖維化和膠原的合成，給予miR-21抑制劑可增加自噬因子LC3Ⅱ和Beclin-1的表達，減輕腎纖維化損傷[3]。本課題組前期研究證實了miR-21通過調(diào)節(jié)人瘢痕成纖維細(xì)胞中PTEN的表達影響成纖維細(xì)胞增殖[4]。本次研究擬探討瘢痕形成中miR-506-3p表達及對自噬相關(guān)因子LC3、Atg5、p62及CollagenⅠ的調(diào)控機制，現(xiàn)報道如下。

1? 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集：收集2018年4月-2019年5月在西安市兒童醫(yī)院皮膚科就診的30例燒傷患者燒傷后24 h內(nèi)的皮膚樣本，燒傷深度為Ⅱ度或Ⅲ度，將每例患者的燒傷皮膚組織和鄰近正常對照皮膚組織標(biāo)本儲存于–80℃液氮中，以備研究。樣本取材前征得患者本人或家屬知情同意，所有實驗操作均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?；颊咝g(shù)前1年內(nèi)未接受任何相關(guān)藥物治療，且無腫瘤病史。

1.2 實驗試劑：人皮膚成纖維細(xì)胞系HSAS4和人胚腎293T（HEK293T）細(xì)胞源自空軍軍醫(yī)大學(xué);DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自HyClone公司;miR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑和相應(yīng)的陰性對照購自RiboBio公司;基因過表達載體（Ad-Beclin-1）和對照載體購自GenScript Biotech公司;PrimeScript RT試劑盒和Mir-XTM miRNA第一鏈合成試劑盒購自大連塔卡拉生物科技有限公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、SYBR PrimeScript? miRNA RT-PCT試劑盒及7900HT實時PCR系統(tǒng)購自美國Biosystems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、熱處理模型構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：將HSAS4和HEK293T細(xì)胞在37℃ 5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，10%胎牛血清DMEM為含100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的抗生素混合物。將HSAS4細(xì)胞培養(yǎng)物放入熱水器槽中，在52℃下孵育30 s，然后在正常條件下孵育，建立細(xì)胞熱處理模型，以模擬燒傷狀態(tài)。將熱處理后的HSAS4細(xì)胞以104個/孔的密度接種到六孔板中，根據(jù)說明書采用Lipofectamine 2 000質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。MiR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑和相應(yīng)的陰性對照（NC模擬物和NC抑制劑）分別轉(zhuǎn)染至HSAS4細(xì)胞，24 h后更換培養(yǎng)基。

1.3.2 RNA提取和RT-qPCR分析：用Trizol試劑分別提取正常皮膚組織、燒傷皮膚組織和轉(zhuǎn)染后HSAS4細(xì)胞的總RNA。反轉(zhuǎn)錄按照Prime Script RT試劑盒和Mir-XTM miRNA第一鏈合成試劑盒說明書進行操作。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過7900HT RT-PCR系統(tǒng)來測量mRNA和miRNA的12 h、24 h、48 h的表達水平，并進行比較。基因特異性引物選用miR-506-3p和β肌動蛋白。獨立操作至少重復(fù)3遍，使用相對定量2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 CCK-8細(xì)胞增殖檢測：CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染48 h后的HSAS4細(xì)胞增殖效率，利用微孔板在0 h、24 h和72 h分別讀取細(xì)胞增殖效率。以1.0×105個細(xì)胞/孔的密度將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于六孔板，并將100μl無FBS的培養(yǎng)基和8μl CCK-8添加至每孔中，于黑暗中孵育2 h。之后在每個特定的時間點（0 h、24 h和72 h）通過測量吸光度（450 nm）檢測細(xì)胞增殖水平。此過程重復(fù)3遍以上。

1.3.4 Western Blot檢測：將RIPA裂解緩沖液分別從正常組織、燒傷后皮膚組織和轉(zhuǎn)染的HSAS4細(xì)胞中獲得總蛋白裂解物，再用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品蛋白并轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后將膜和以下第一抗體分別在4℃下過夜孵育：LC3B（1︰300），p62（1︰400），Atg5（1︰300），LH2（1︰500）和CollagenⅠ（1︰800）。β肌動蛋白被設(shè)置為內(nèi)源性對照物。最后將膜與第二抗體IgG再在室溫下孵育2 h。顯影曝光后，用ECL-Plus Western Blot系統(tǒng)分析靶基因的相對表達水平。所有實驗重復(fù)3遍以上。

1.4 觀察指標(biāo)：采用熒光定量RT-qPCR、Western Blot檢測正常皮膚組織、燒傷組織和熱損傷HSAS4細(xì)胞、正常皮膚成纖維細(xì)胞的miR-506-3p和自噬相關(guān)因子（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、p62及CollagenⅠ）表達水平;采用RT-qPCR檢測miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到HSAS4細(xì)胞中對上述自噬相關(guān)因子表達水平的影響;利用CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染HSAS4細(xì)胞增殖效率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行分析，實驗至少獲得3次數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。組間比較進行配對t檢驗，兩組以上使用單向方差分析，P<0.05顯示為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 正常皮膚組織和燒傷組織中miR-506-3p、LC3、Atg5、p62及CollagenⅠ的表達：30例患者正常組織及燒傷組織樣本采用RT-qPCR檢測miR-506-3p的表達水平。燒傷組織中miR-506-3p的表達水平較正常組織下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖1;同時，在燒傷組織中，自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ也顯著上調(diào)，而p62的表達則下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.2 正常皮膚成纖維細(xì)胞和熱損傷HSAS4細(xì)胞中miR-506-3p以及自噬相關(guān)因子的表達：結(jié)果表明，不同時段熱損傷HSAS4細(xì)胞的miR-506-3p的表達低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，且在48 h時熱損傷HSAS4細(xì)胞的miR-506-3p表達下調(diào)最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。不同時段熱損傷HSAS4細(xì)胞中自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ也顯著上調(diào)，而p62的表達則下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

2.3 miR-506-3p對熱損傷HSAS4細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及自噬相關(guān)因子表達的影響：在熱刺激條件下，將miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到HSAS4細(xì)胞中，以實現(xiàn)miR-506-3p過表達或低表達。RT-qPCR結(jié)果表明，通過miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染可顯著降低miR-506-3p表達，而通過miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染可提高miR-506-3p的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。進一步的實驗中，將miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到HSAS4細(xì)胞中，自噬相關(guān)因子的檢測結(jié)果表明，抑制miR-506-3p促進了自噬（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和Atg5上升，p62降低）和CollagenⅠ表達，而miR-506-3p的過表達則顯示出相反的作用，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見圖6。

2.4 miR-506-3p對熱損傷HSAS4細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8分析表明，抑制miR-506-3p可顯著增強細(xì)胞活力，而miR-506-3p過表達則減少了細(xì)胞增殖，見圖7。

3? 討論

病理性瘢痕形成是創(chuàng)傷修復(fù)的產(chǎn)物，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)CollagenⅠ、Ⅲ聚集。越來越多的證據(jù)表明，miRNA與細(xì)胞自噬及增生性瘢痕的關(guān)系密切[5]。miRNA對皮膚組織成纖維細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞行為具有重要作用，Liu等[6]證實miR-181b-5p通過調(diào)節(jié)MEK/ERK/p21途徑促進增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。另外，有研究顯示miR-506可影響人類不同疾病的細(xì)胞生長、分化、癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲，如宮頸癌[7]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[8]及肺纖維化[9]等。本次研究表明，在燒傷的皮膚組織和熱損傷的皮膚成纖維細(xì)胞中，miR-506-3p表達顯著下調(diào)。成纖維細(xì)胞增殖異常是瘢痕組織過度生長和持續(xù)存在的主要原因[10]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，熱刺激皮膚成纖維細(xì)胞miR-506-3p過表達顯著降低了細(xì)胞的增殖能力，提示miR-506-3p在燒傷皮膚的愈合及瘢痕形成中發(fā)揮著重要作用。

自噬是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的再利用及穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。自噬與病理性瘢痕等纖維化疾病密切相關(guān)[11]，其通過參與成纖維細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解、細(xì)胞因子的分泌等，在瘢痕形成的各階段發(fā)揮著不同作用。越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與調(diào)控自噬的發(fā)生，在多個自噬通路中扮演著關(guān)鍵性角色，如慕生枝等[12]發(fā)現(xiàn)miR-203過表達可抑制人瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，其機制可能是通過靶向抑制ΔNp63的表達進而上調(diào)P53的蛋白表達;Chen等[13]發(fā)現(xiàn)miR-30a通過靶向Beclin-1來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的自噬;盧新星等[14]發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞miR-21過表達可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化，降低LC3-Ⅱ表達和增加p62水平，降低自噬水平而減少細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)堆積。本實驗結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比，燒傷組織和熱損傷皮膚的成纖維細(xì)胞中miR-506-3p的表達均下調(diào)，自噬相關(guān)因子（如LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ）顯著上調(diào)，而p62的表達則下調(diào)，表明自噬水平上調(diào)，說明熱刺激促進了真皮成纖維細(xì)胞中的自噬。

為進一步驗證miR-506-3p調(diào)控自噬水平的能力，筆者將miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到真皮成纖維細(xì)胞中，實現(xiàn)miR-506-3p過表達或低表達，通過檢測自噬相關(guān)因子來反映自噬水平。結(jié)果顯示，抑制miR-506-3p表達可促進細(xì)胞自噬并增加CollagenⅠ表達，而miR-506-3p的過表達則顯示出相反作用，提示自噬在燒傷組織發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，也進一步揭示miR-506-3p能夠負(fù)性調(diào)控自噬水平，具體的分子機制尚待進一步研究。

綜上所述，燒傷組織和熱損傷的成纖維細(xì)胞中miR-506-3p表達下調(diào)，自噬水平上調(diào)，miR-506-3p過表達可抑制皮膚成纖維細(xì)胞的自噬和增殖，提示miR-506-3p有可能成為燒傷愈合后瘢痕潛在的治療靶標(biāo)。

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[收稿日期]2021-02-04

本文引用格式：史敏，丁欣強，郭曉波，等.MiR-506-3p與自噬相關(guān)因子在燒傷后皮膚成纖維細(xì)胞中的表達研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，31（5）：86-89.