徐 韜，陳 晨，楊 飛，田 樓，楊 陽(yáng)▲

(1貴州師范大學(xué)材料與建筑工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引言

湖泊微生物作為食物網(wǎng)重要的組成成分，發(fā)揮著重要的作用。水庫(kù)中的沉積物是水庫(kù)內(nèi)源污染源[1]。表層沉積物是微生物聚居和進(jìn)行物質(zhì)代謝和循環(huán)的主要場(chǎng)所和介質(zhì)，微生物通過(guò)同化分解等代謝過(guò)程來(lái)影響沉積物中甚至水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽及污染物的分布、轉(zhuǎn)化和利用等。細(xì)菌在微食物網(wǎng)中對(duì)物質(zhì)和能量的循環(huán)起著關(guān)鍵的作用。沉積物細(xì)菌種類豐富，代謝活性高，且對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)迅速，因此，水體沉積物微生物群落可以作為水環(huán)境變化和演替的重要指標(biāo)，對(duì)了解水環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)和污染狀態(tài)有重要作用[2]。目前，已有大量對(duì)湖泊/水庫(kù)沉積物微生物群落的研究，然而，對(duì)貴州省內(nèi)云貴高度的湖泊/水庫(kù)中水體和沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)、分布還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[3-5]。云貴高原湖泊區(qū)是中國(guó)五大湖區(qū)最小的湖區(qū)[6]，相對(duì)于平原水體，高原湖泊/水庫(kù)相對(duì)獨(dú)立，對(duì)氣候變化敏感，且對(duì)認(rèn)為的干擾更加敏感。高原水體中蘊(yùn)含著大量的微生物資源，因此，對(duì)其中微生物群落的研究能夠幫助我們更清楚地認(rèn)識(shí)貴州省內(nèi)高原水庫(kù)中微生物的群落特征，從而進(jìn)一步了解水體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和物質(zhì)循環(huán)機(jī)制。

傳統(tǒng)微生物的研究離不開(kāi)微生物的分離和培養(yǎng)，然而自然界中，尤其是水體中的絕大部分微生物很難在實(shí)驗(yàn)室被培養(yǎng)[7]。隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)沉積物微生物群落的研究主要基于測(cè)序的手段開(kāi)展，包括擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序等技術(shù)。測(cè)序技術(shù)為從群落水平了解水體微生物的生態(tài)特征打開(kāi)了新篇章[8-9]。然而，研究中對(duì)沉積物樣品的采集和處理存在不同，有的研究選擇于采樣時(shí)直接保存沉積物待DNA提取[10-14]，有的研究則進(jìn)行風(fēng)干過(guò)篩處理后再進(jìn)行DNA提取[15-16]。那么，原始沉積物和風(fēng)干過(guò)篩處理后的沉積物中微生物群落是否有較大的差異呢？造成這些差異的原因是什么呢？本研究選取烏江渡水庫(kù)4個(gè)采樣點(diǎn)的沉積物，分別進(jìn)行風(fēng)干處理和風(fēng)干后過(guò)篩處理，對(duì)處理后和原始的沉積物進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，在初步了解烏江渡水庫(kù)沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較分析風(fēng)干和過(guò)篩處理對(duì)沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，從而為沉積物微生物樣品的處理提供了數(shù)據(jù)支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

烏江渡水庫(kù)位于烏江流域，是西南地區(qū)重要的水系之一。烏江渡水庫(kù)地處貴州省息烽縣和遵義縣交界處，是烏江干流第十一個(gè)梯級(jí)電站的第六級(jí)，為典型的峽谷型水庫(kù)。該水庫(kù)屬于季節(jié)性調(diào)水，總庫(kù)容23億m3，平均水深154 m，水庫(kù)總面積48 km2。烏江流域的水庫(kù)均有不同程度的水產(chǎn)養(yǎng)殖，因此，其水體沉積物中有不同程度的營(yíng)養(yǎng)鹽和重金屬聚集[17]。該水庫(kù)平均水力滯留時(shí)間為30～135天(豐水期和枯水期)。

于2021年5月在烏江渡水庫(kù)設(shè)置4個(gè)采樣點(diǎn)，分布為江口(JK)、漩塘(XT)、息烽河(XF)和偏巖河(PY)(圖1)。采樣點(diǎn)選取在干流與支流的交匯處，沿著烏江流域分布。采用抓斗式采泥器采集沉積物樣品，收集表層(0～5 cm)的沉積物，于冰盒中保存，每個(gè)采樣點(diǎn)抓取3次，混合后成為1個(gè)樣品，每個(gè)樣品分成3份，1份直接保存為原始沉積物，1份自然風(fēng)干5天后凍存(dried)，另1份自然風(fēng)干5天后過(guò)100目篩后凍存(filtered)。

圖1 烏江渡采樣點(diǎn)地理位置分布圖Fig.1 Distribution of sampling sites in Wujiangdu Reservoir

1.2 沉積物DNA提取和測(cè)序

用ALFA-seq Advanced Soil DNA kit試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性和純度，利用NanoDrop One檢測(cè)DNA濃度和純度。以基因組DNA為模板，選擇515F和806R引物對(duì)16S v4-v5區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫(kù)，之后使用Illumina Hiseq2500 平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行PE250測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)paired-end raw read數(shù)據(jù)過(guò)濾和拼接獲得原始拼接序列，用Mothur軟件進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾后得到有效的拼接片段(Clean Tags)。用usearch軟件對(duì)所有樣品的全部clean tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTU。為了有效地后序分析，利用Qiime從每個(gè)OTU所屬的序列中，抽取出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列來(lái)代表相應(yīng)的OTU。利用Qiime中的assign_taxonomy.py腳本和RDP Classifier方法，將每個(gè)OTU的代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得物種注釋信息，從而得出所有序列物種來(lái)源。利用PICRUSt軟件，基于OTU的物種注釋和豐度信息，將KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中已有基因組的原核生物16S rRNA序列與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rRNA序列進(jìn)行關(guān)聯(lián)，然后將KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)已有的原核物種基因組進(jìn)行序列。

用R軟件進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理，主要包括計(jì)算群落多樣性指數(shù)(OTU數(shù)目、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、均勻度指數(shù)、Chao1和ACE)和Bray-Curtis距離。方差分析(ANOVA)用于比較不同處理直接細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的差異，運(yùn)用PCoA排序方法研究不同處理細(xì)菌群落的相似性，ANOVA和PCoA使用“vegan”程序包進(jìn)行[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物微生物群落組成

在原始沉積物中，4個(gè)采樣點(diǎn)共檢測(cè)到5869-6210個(gè)OTUs，風(fēng)干或過(guò)篩處理后分別檢測(cè)到6359-6488個(gè)和6186-6414個(gè)OTUs。在門(mén)水平上，原始、風(fēng)干和過(guò)篩后沉積物的微生物群落中，變形菌門(mén)(Proteobacteria)為主要優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度均大于30%，其相對(duì)豐度在風(fēng)干和過(guò)篩后有一定程度的降低。綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)的相對(duì)豐度在風(fēng)干和過(guò)篩處理后升高，成為次優(yōu)勢(shì)類群。其次在風(fēng)干和過(guò)篩處理組為擬桿菌門(mén)(Bacteriodetes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)，而在原始沉積物中為Bacteriodetes和硝化螺旋菌門(mén)(Nitropspirae)。Actinobacteria在風(fēng)干和過(guò)篩后其相對(duì)豐度從 3.5%升高至7.5%和7.8%(圖2)。

圖2 各處理組沉積物微生物群落優(yōu)勢(shì)類群(門(mén)水平和綱水平)相對(duì)豐度(control：原始沉積物；dried：風(fēng)干沉積物；filtered：過(guò)篩沉積物)Fig.2 Relative abundance of dominant bacterial groups bydifferent treatment(phylum and class level)

Proteobacteria在各組中均為優(yōu)勢(shì)類群，主要包括γ-Proteobacteria，Δ-Proteobacteri和α-Proteobacteria。其中，γ-Proteobacteria為主要優(yōu)勢(shì)類群，分別占比19%、16.6%和16.1%，在原始沉積物中，第二優(yōu)勢(shì)類群為Δ-Proteobacteria(10.8%)，這一類群在風(fēng)干處理組和過(guò)篩處理組中相對(duì)豐度降低，α-Pro-teobacteria的相對(duì)豐度為5.3%、5.5%和5.7%。Chloroflexi中厭氧繩菌綱(Anaerolineae)的相對(duì)豐度從原始沉積物中的7.4%升高至12.9%和11.4%。

選取5類門(mén)水平和綱水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在原始沉積物、風(fēng)干和過(guò)篩沉積物中存在顯著性差異。將風(fēng)干和過(guò)篩兩組處理進(jìn)行對(duì)比，在門(mén)水平和綱水平上，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌差異均不顯著(p>0.05)。

表1 不同處理沉積物中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度方差分析Tab.1 ANOVA analysis of the relative abundance of dominantbacterial groups by different treatment

2.2 沉積物微生物群落多樣性比較

風(fēng)干處理后微生物OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)增多，原始沉積物中OTU數(shù)目最少。Simpson、Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)無(wú)較大差異。ANOVA檢測(cè)結(jié)果顯示各個(gè)采樣點(diǎn)之間的多樣性指數(shù)差異不顯著(p>0.1)(圖3)。

圖3 烏江渡水庫(kù)各采樣點(diǎn)多樣性指數(shù)(JK：江口；PY：偏巖；XF：息烽；XT：漩塘)Fig.3 Diversity indexes of each sampling site inWujiangdu Reservoir

2.3 沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)和功能比較

原始沉積物微生物群落異質(zhì)性較高，4個(gè)采樣點(diǎn)微生物群落差異較大，而風(fēng)干和過(guò)篩之后的沉積物中微生物群落在圖中分布集中，而原始沉積物群落分布范圍較大，相互之間有一定的距離(圖4)。PerMANOVA檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除了種水平上群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(p=0.34)，其他分類水平(包括：屬、科、目、綱)上風(fēng)干和過(guò)篩處理后微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著的差異(p<0.01)?；诓煌姆诸愃降臄?shù)據(jù)進(jìn)行NMDS排序分析，排序圖中風(fēng)干和過(guò)篩處理后的沉積物微生物群落較原始微生物群落更為集中。韋恩圖結(jié)果顯示三組處理沉積物微生物群落有共同OTU 154個(gè)，原始沉積物、風(fēng)干和過(guò)篩處理后沉積物微生物群落特有OTU，分別為80個(gè)、66個(gè)和67個(gè)(圖5)。

圖4 沉積物微生物群落排序(Control：原始沉積物；dried： 風(fēng)干沉積物；filtered：過(guò)篩沉積物)Fig.4 PCoA ordination of sediment bacterial communities

圖5 不同處理沉積物微生物Venn圖(A：原始沉積物；B：風(fēng)干沉積物；C： 過(guò)篩沉積物)Fig.5 Venn diagram of sediment bacterial communities bydifferent treatments

將各個(gè)采樣點(diǎn)原始、風(fēng)干和過(guò)篩后的沉積物微生物群落進(jìn)行比較分析，計(jì)算Bray-Curtis距離發(fā)現(xiàn)，在種屬水平上，XF站點(diǎn)群落結(jié)構(gòu)差異最大，而在門(mén)、綱、目和科水平上，PY站點(diǎn)群落差異最大(圖6)。

圖6 各采樣點(diǎn)原始、風(fēng)干和過(guò)篩后沉積物中微生物不同分類水平上群落Bray-Curtis距離(a.Species： 種；b.Genus：屬；c.Family：科；d.Order：目；e.Class：綱；f： Phylum：門(mén)；JK：江口；PY：偏巖；XF：息烽；XT：漩塘)Fig.6 Bray-Curtis distance of sediment bacterial communitiesby different treatments at different taxonomic levels

不同處理沉積物微生物群落16S基因預(yù)測(cè)功能進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，16S基因功能預(yù)測(cè)注釋主要為代謝相關(guān)基因，其次為基因信息處理相關(guān)(圖7)。三組處理直接預(yù)測(cè)功能基因相對(duì)豐度無(wú)顯著差異，其中功能集中在以碳水化合物代謝、氨基酸代謝和輔助因子及維生素代謝相關(guān)的基因(圖7b)。

圖7 基因功能注釋KEGG基因相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of KEGG functional genes

3 討論

3.1 烏江渡水庫(kù)沉積物細(xì)菌群落特征

湖泊/水庫(kù)沉積物中主要優(yōu)勢(shì)類群包括變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等[19]，這與本研究的結(jié)果一致。烏江渡水庫(kù)沉積物中的主要優(yōu)勢(shì)類群為Proteobacteria，其中主要包括γ-Proteobacteria和Δ-Proteobacteria。這些微生物在水體有機(jī)物污染降解、碳循環(huán)和地球化學(xué)循環(huán)中起到重要作用。Poteobacteria可能與底泥的各種營(yíng)養(yǎng)鹽及其生物化學(xué)過(guò)程有密切關(guān)系。大多數(shù)Proteobacteria在碳和氮代謝過(guò)程中具有重要作用，尤其對(duì)于可降解的有機(jī)質(zhì)具有很強(qiáng)的代謝能力，在富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見(jiàn)。其中α-Proteobacteria，β-Proteobacteria，γ-Proteobacteria中包含許多反硝化細(xì)菌，能夠進(jìn)行自養(yǎng)或異養(yǎng)反硝化。Chloroflexi為光能自養(yǎng)型細(xì)菌，兼性厭氧，也存在專性厭氧菌[20]，可以在不同條件下生存，其中多數(shù)種類與有機(jī)污染物降解有關(guān)。作為優(yōu)勢(shì)類群之一的綠彎菌，可能在烏江渡水庫(kù)的污染物降解方面起著重要作用。放線菌門(mén)在降解有機(jī)物過(guò)程中起著主要作用，擬桿菌門(mén)主要參與湖泊中亞硝酸鹽還原過(guò)程[21]。

3.2 不同處理沉積物微生物群落比較

原始沉積物與風(fēng)干和過(guò)篩處理后微生物群落比較發(fā)現(xiàn)，其中主要優(yōu)勢(shì)類群一致，但是其相對(duì)豐度發(fā)生了一定程度的變化。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Proteobacteria和Actinobacteria存在顯著的豐度差異，而其他優(yōu)勢(shì)類群，包括Chloroflexi，Acidobacteria，和Bacteroidetes沒(méi)有顯著的豐度差異。在綱水平上，Δ-Proteobacteria 存在顯著差異。Proteobacteria是水體微生物群落的典型細(xì)菌類群[22]。沉積物中γ-變形菌和Δ-變形菌在變形菌門(mén)中占主導(dǎo)地位，這是因?yàn)樵擃惾褐杏写罅颗c氮、硫元素代謝相關(guān)的菌群，與物質(zhì)循環(huán)息息相關(guān)[12]。厚壁菌門(mén)能促進(jìn)植物殘留物的降解，其中的芽孢桿菌和梭菌適應(yīng)性和繁殖力強(qiáng)，能產(chǎn)生芽孢耐受風(fēng)干研磨這類的環(huán)境壓力[23]。Acidobacteria(酸桿菌門(mén))生態(tài)幅較寬，能夠適應(yīng)多種環(huán)境條件。

風(fēng)干和過(guò)篩處理后沉積物微生物群落多樣性改變，但是其群落多樣性指數(shù)差異不顯著。該結(jié)果表明，微生物群落組成上多樣性并未發(fā)生顯著的改變，風(fēng)干處理和過(guò)篩處理，可以被視為一種環(huán)境選擇因子，改變了細(xì)菌群落中各個(gè)類群的相對(duì)豐度。面對(duì)環(huán)境脅迫各個(gè)菌門(mén)的響應(yīng)有所不同，這與不同類群細(xì)菌具有的生理特性相關(guān)。另一方面，可能是由于擴(kuò)增子測(cè)序，有許多序列無(wú)法注釋到目以上的分類水平。其次，風(fēng)干和風(fēng)干后過(guò)篩處理兩者之間差異較小。此外，原始沉積物由于含水量較高，表層沉積物與水體的物質(zhì)交換頻繁，許多水體中的細(xì)菌也會(huì)出現(xiàn)在表層沉積物中。因此，沉積物含水量是導(dǎo)致沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子。失水成為環(huán)境選擇壓力，篩選出能夠適應(yīng)干旱條件的微生物種類，同時(shí)對(duì)干旱敏感的細(xì)菌類群將被淘汰。細(xì)菌的孢子(厚壁菌門(mén)的內(nèi)孢子、放線菌的外生孢子)被認(rèn)為是細(xì)菌脫水耐性的機(jī)制[24]。

烏江渡水庫(kù)不同采樣點(diǎn)沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，各個(gè)采樣點(diǎn)沉積物不同處理后的差異大小也不同。息烽采樣點(diǎn)(XF)位于息烽河口處，附近有一座磷肥廠，加上網(wǎng)箱養(yǎng)魚(yú)投放的餌料等[17，25]，造成了息烽河水體營(yíng)養(yǎng)鹽濃度較高，水質(zhì)受到礦產(chǎn)污染影響較大。此外，息烽河周?chē)彐?zhèn)居民耕作使用農(nóng)藥化肥等隨地表徑流進(jìn)入河流和水庫(kù)，與該水庫(kù)水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)化程度和污染狀態(tài)的空間異質(zhì)性有關(guān)。

烏江渡水庫(kù)沉積物中微生物代謝基因主要集中在碳水化合物、氨基酸代謝方面。對(duì)不同處理后沉積物微生物群落16S基因功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，風(fēng)干和過(guò)篩處理并未對(duì)微生物群落8類生物代謝通路基因有顯著影響。

4 結(jié)論

(1)烏江渡沉積物細(xì)菌群落存在空間異質(zhì)性，不同地理位置沉積物群落結(jié)構(gòu)存在差異，這主要是由各處不同的環(huán)境條件決定的。

(2)烏江渡沉積物細(xì)菌群落在風(fēng)干和過(guò)篩處理后存在顯著差異，其中優(yōu)勢(shì)類群的相對(duì)豐度發(fā)生變化，風(fēng)干和過(guò)篩處理的脫水過(guò)程對(duì)其中的微生物造成脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)的變化。風(fēng)干和過(guò)篩處理二者之間的差異不顯著。

(3)風(fēng)干和過(guò)篩處理并未導(dǎo)致沉積物細(xì)菌群落多樣性和基因功能發(fā)生顯著差異。

(4)建議對(duì)水體沉積物微生物的研究使用原始沉積物進(jìn)行DNA提取測(cè)序，不推薦進(jìn)行風(fēng)干或者過(guò)篩處理。