萬信良，招浩熙，賀 穎，蔣洋洋，龍 楠，黃 聰

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

雄激素性脫發(fā)(Androgenetic alopecia，AGA)是臨床皮膚科最常見的脫發(fā)類疾病之一。AGA的發(fā)生主要與雄激素代謝紊亂相關(guān)，是雄激素依賴性遺傳性疾病之一[1]。同時，?ztürk Perihan[2]研究發(fā)現(xiàn)雄激素在AGA當(dāng)中亦占有較重要的地位。據(jù)有關(guān)調(diào)查統(tǒng)計[3]，我國約有21.3%的男性和6.0%的女性不同程度地患有雄激素性脫發(fā)。AGA癥狀主要表現(xiàn)為患者發(fā)量逐漸減少、毛發(fā)逐漸纖細等。AGA在對毛囊破壞的同時，也對患者精神狀態(tài)方面造成了一定程度的影響，出現(xiàn)焦慮、抑郁等心理疾病[4]。目前，AGA的病因及發(fā)病機制尚未明確，但其發(fā)病機制與5α-還原酶、雙氫睪酮(DHT)和雄激素受體(AR)之間的相互作用密切相關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過特異性抑制Ⅱ型5α還原酶或增強鉀離子通道開放以達到抑制睪酮(T)轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮(DHT)、促進頭皮毛細血管增生及毛囊細胞增殖的作用。臨床上主要以非那雄胺、米諾地爾為常見的AGA治療藥物。但口服非那雄胺后可能會出現(xiàn)性功能障礙及焦慮抑郁為主要癥狀的“非那雄胺綜合征”，使用米諾地爾可能導(dǎo)致局部炎癥、水腫、心悸等不良反應(yīng)[5]。

AGA在中醫(yī)學(xué)中屬于“發(fā)斑脫發(fā)”“駐發(fā)廯”范疇，以肝腎虧虛、血虛風(fēng)燥、濕熱浸潤為主要病機?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩唬骸罢煞虬藲q，腎氣實，發(fā)長齒更……五八，腎氣衰，發(fā)墮齒槁”“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長……五七，陽明脈衰，發(fā)始墮”，說明毛發(fā)的生長與腎氣關(guān)系密切；《素問·六節(jié)藏象篇》曰“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，其華在發(fā)”“肺者，氣之本，其華在毛”，說明毛發(fā)需要腎精滋潤，肺氣宣發(fā)才得以正常生長。自擬黃芪首烏酊方以黃芪、制首烏、熟地黃、墨旱蓮、女貞子、側(cè)柏葉、桔梗、生姜等八味藥物組成，方中黃芪、何首烏共為君藥，補氣益血，調(diào)補肝腎；臣以墨旱蓮、女貞子、熟地黃以補腎填精，烏發(fā)生發(fā)；佐以側(cè)柏葉、桔梗，清熱涼血，宣發(fā)肺氣；使以生姜，引歸肺經(jīng)；諸藥合用，共奏補肝益腎、宣發(fā)肺氣的功效。

黃芪首烏酊復(fù)方成分的復(fù)雜性對其具體活性成分、相關(guān)靶點及信號通路等方面的研究也產(chǎn)生了制約作用。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個新興于大數(shù)據(jù)時代并利用人工智能系統(tǒng)性地對藥物進行研究的學(xué)科，其以現(xiàn)代生物信息技術(shù)為基礎(chǔ)，通過對藥物、活性成分、靶點及疾病之間的關(guān)聯(lián)規(guī)律分析，對中藥及其復(fù)方治療相關(guān)疾病的潛在作用進行數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)分析，對我們進行中醫(yī)藥的現(xiàn)代研究有客觀促進作用[6]。而目前基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥及復(fù)方成分對于治療AGA的作用機制方面尚屬空白，因此本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃芪首烏酊治療AGA的作用機制，為治療AGA提供新的研究思路及相關(guān)數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪首烏酊的有效活性成分及藥物靶點的篩選

利用TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索黃芪、墨旱蓮、女貞子、熟地黃、側(cè)柏葉、桔梗、生姜的主要化學(xué)成分，對比藥物動力學(xué)參數(shù)(ADME)，將其標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為口服利用度(oral bioavailability，OD)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，通過以上兩項關(guān)鍵指標(biāo)篩選黃芪、墨旱蓮、女貞子、熟地黃、側(cè)柏葉、桔梗、生姜的有效活性化合物；利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索與何首烏相關(guān)的有效化學(xué)成分，將相關(guān)閾值Score cutoff≥20，Pvalue≤0.05作為限定條件初步篩選何首烏活性化合物。選取具有明確作用靶點的活性成分作為黃芪首烏酊候選活性化合物，同時，提取以上藥物的靶點蛋白，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)規(guī)范靶點蛋白名稱。

1.2 AGA靶點收集

在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http：//www.disgenet.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)以“Androgenetic alopecia”為檢索詞，檢索AGA的相關(guān)靶點，并整合記錄，以靶點基因的Score值為參照，AGA的候選靶點以Score值大于中位值的目標(biāo)靶點為準(zhǔn)。

1.3 黃芪首烏酊有效活性成分及藥物靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪首烏酊的有效活性成分及靶點信息導(dǎo)入cytoscape3.7.2軟件，繪制黃芪首烏酊藥物-有效活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 黃芪首烏酊-AGA蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將已篩的藥物靶點與AGA疾病靶點取核心靶點交集基因后導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)，進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓撲分析，將得到的初步PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入cytoscape3.7.2軟件，將初步的PPI蛋白拓撲分析網(wǎng)絡(luò)圖進行可視化處理。

1.5 GO和KEGG的富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov)對黃芪首烏酊治療AGA的靶點進行GO及KEGG分析，將物種設(shè)定為“Homo sapiens”，整合2個數(shù)據(jù)庫結(jié)果，選取Pvalue前20的結(jié)果(分析結(jié)果≤20的以總數(shù)計算)進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 黃芪首烏酊有效活性成分及作用靶點蛋白的篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索獲得黃芪活性成分15個，何首烏活性成分16個，女貞子活性成分8個，墨旱蓮活性成分8個，熟地黃活性成分2個，側(cè)柏葉活性成分7個，桔?；钚猿煞?個，生姜活性成分4個。其中共有活性成分5個，合并去重后獲得黃芪首烏酊活性成分53個。利用Uniprot對靶點進行規(guī)范化命名，最終得到黃芪首烏酊相關(guān)靶點基因360個。將有效活性成分及相關(guān)靶點基因?qū)隿ytoscape3.7.2中，構(gòu)建“中藥-有效活性成分-靶點基因”網(wǎng)絡(luò)，統(tǒng)一對黃芪首烏酊的藥物、有效活性成分、靶點基因進行規(guī)范命名：圓形代表各味中藥，藥物采用藥名的大寫首字母為編號，如黃芪的編號為“HQ”；正六邊形代表有效活性成分，其中各藥物唯一成分采用藥名的大寫首字母加數(shù)字的形式，如HQ1、HQ2、HQ3等，多種藥物共有成分以A1、A2、B1等作為編碼；菱形代表靶點基因。同時，運用軟件中的“Analyze Network”，進行度值(degree)計算，度值大小由該節(jié)點與其他節(jié)點交集度決定，若度值越大，節(jié)點面積(Node)越大，連線(Edge)越粗。構(gòu)建出的“中藥-有效活性成分-靶點基因”(圖1)。同時，從圖1中可觀察到槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、7-O-甲基異鼠李糖醇(7-O-methylisomucronulatol)、芒柄花素(formononetin)等度值較大，推測這些有效活性成分在黃芪首烏酊治療AGA當(dāng)中發(fā)揮了重要作用，如表1所示。

圖1 中藥-有效活性成分-靶點基因網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of traditional Chinese medicine-activecomponents-target gene

表1 黃芪首烏酊治療AGA的主要成分Tab.1 Main effective ingredients of the milkvetchroot-fleeceflower root tincture in the treatment of AGA

2.2 AGA靶點收集結(jié)果

通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫獲取“Androgenetic alopecia”的相關(guān)靶點基因，并將靶點基因從大到小排列，取Score值中位數(shù)1.45，將其大于1.45的靶點基因選取，合并去重后得到相關(guān)靶點428個。

2.3 黃芪首烏酊治療AGA靶點整合

通過將黃芪首烏酊活性成分靶點與AGA疾病靶點進行交集分析，獲得35個黃芪首烏酊治療AGA的共同靶點。并利用Bioinformatics(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線軟件繪制黃芪首烏酊成分-AGA靶點Venn圖，如圖2所示。

圖2 黃芪首烏酊有效活性成分AGA共同靶點Fig.2 Intersection targets of the main effective ingredients ofthe milkvetch root-fleeceflower root tincture and AGA

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)的構(gòu)建

將黃芪首烏酊治療AGA的藥物靶點經(jīng)String數(shù)據(jù)庫得到的初步PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，并利用“Analyze Network”繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該PPI網(wǎng)絡(luò)圖當(dāng)中含有35個節(jié)點(nodes)，306條邊(edges)，平均節(jié)點度值為17.5；節(jié)點度值越大，則顏色越紅，面積越大，連線越粗。取前20個交集靶點作為核心靶點進行富集分析。繪制出的黃芪首烏酊有效活性成分-AGA靶點PPI圖(圖4)，由圖所示，黃芪首烏酊可能通過血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、白細胞介素6(IL6)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、雄激素受體(AR)等關(guān)鍵靶點發(fā)揮治療AGA的作用。

圖3 黃芪首烏酊有效活性成分-AGA靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network map of the targets of the main effectiveingredients of the milkvetch root-fleeceflower roottincture and AGA

圖4 GO富集分析(BP)Fig.4 Analysis of GO enrichment(BP)

2.5 GO功能富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫對黃芪首烏酊治療AGA的核心靶點進行GO功能富集分析，經(jīng)過校正Pvalue，設(shè)定P<0.01后，提取前20個生物學(xué)過程(BP)條目，其中主要涉及上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、對生長因子的反應(yīng)(response to growth factor)、細胞對脂質(zhì)的反應(yīng)(cellular response to lipid)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)、通過STAT 的受體信號通路(receptor signaling pathway via STAT)等，見圖5所示；總共獲取5個分子功能(MF)條目，其中主要涉及受體配體活性(receptor ligand activity)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)等，見圖6所示；總共獲取2個細胞組成(CC)條目，其中主要涉及囊泡腔(vesicle lumen)、血小板α顆粒腔(platelet alpha granule lumen)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、細胞質(zhì)囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體(transcription regulator complex)等，見圖7。

圖5 GO富集分析(MF)Fig.5 Analysis of GO enrichment(MF)

圖6 GO富集分析(CC)Fig.6 Analysis of GO enrichment(CC)

圖7 KEGG富集分析通路集群Fig.7 Analysis of KEGG enrichment of pathway cluster

2.6 KEGG信號通路富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫對KEGG信號通路進行富集分析，并使用Cytoscape3.7.2構(gòu)建治療靶點基因-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。通過整合Metascape數(shù)據(jù)庫與DAVID數(shù)據(jù)庫，經(jīng)KEGG分析得到信號通路76條，設(shè)定P<0.01，最小計數(shù)為3且富集因子> 1.5，并取排名前20的信號通路建立氣泡圖，并根據(jù)其成員相似性將其分組到相應(yīng)集群中?？偣搏@取信號通路集群10組，主要涉及PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、細胞因子與其受體之間的相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)等，見圖8所示。通過KEGG通路富集分析獲取的氣泡圖可觀察到，排名前20的信號通路主要涉及PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、膀胱癌(Bldder cancer)、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、細胞因子與其受體之間的相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等。

圖8 KEGG通路富集分析Fig.8 Analysis of KEGG pathway enrichment

3 討論

3.1 藥物有效活性成分分析

通過本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪首烏酊發(fā)揮補益肝腎、宣發(fā)肺氣功效的主要活性成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、7-O-甲基異鼠李糖醇、芒柄花素等。其中，槲皮素通過抑制CYP17A1 基因表達發(fā)揮了對磷脂酰肌醇3-激酶合成雄激素的抑制作用[7]；山奈酚可通過調(diào)節(jié)促炎基因以及阻斷NF-kB 和 AP-1來發(fā)揮抗炎作用，因炎癥因子對雄激素代謝呈正相關(guān)影響[8]，因此，山奈酚可通過發(fā)揮抗炎作用抑制雄激素的分泌增多；譙旭芳[9]研究表明木犀草素可降低大鼠血清中的二氫睪酮(DHT)水平以及對雄激素受體(AR)的表達產(chǎn)生顯著抑制作用；吳國欣[10]等研究明確β-谷甾醇可對小鼠血清酸性磷酸酶活力產(chǎn)生抑制作用，進而發(fā)揮了抗雄激素及抗炎的活性作用；豆甾醇可通過降低環(huán)氧合酶-2( Cox-2 )和NF - kB( p65 )的表達以達到減少氧化刺激和炎癥的目的[11]，因炎癥因子與雄激素的代謝呈正相關(guān)關(guān)系，故豆甾醇可通過抗炎相關(guān)機制達到抑制雄激素分泌增多的目的；芒柄花素可對T47D細胞ERα表達起到增強作用[12]，而增強激動ERα表達可使雌激素分泌增多，在雌激素對多種炎癥性疾病的調(diào)節(jié)下[13]，可通過抗炎機制對雄激素分泌增多進行抑制。綜上所述，黃芪首烏酊當(dāng)中的關(guān)鍵活性成分通過抑制雄激素合成、發(fā)揮抗炎機制作用、增強激動雌激素受體α(ERα)表達能力等方面對AGA的治療具有潛在作用。

3.2 共同靶點分析

圖4顯示，VEGFA、EGFR、IL6、AKT1、AR等靶點在黃芪首烏酊治療AGA當(dāng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AKT1是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對細胞的增殖和凋亡具有調(diào)控作用。其通過參與PI3K/Akt信號通路正向調(diào)控或負向調(diào)控AR蛋白的表達，而AR也可通過不同途徑抑制或激活A(yù)kt[14]。黃芪、制首烏可通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活[15-16]，負向調(diào)控AR蛋白的表達，達到抑制雄激素分泌、治療AGA的目的。VEGFA是重要的血管內(nèi)皮生長因子之一，EGFR是一種重要的生長因子受體，兩者在對促進血管生成、增強毛囊周圍微循環(huán)、促進毛囊再生方面發(fā)揮著重要作用[17]。黃芪提取物可通過升高VEGF的表達，促進新生血管的形成[18]；也可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮對表皮干細胞增殖分化的促進作用[19]。IL-6是具有免疫調(diào)節(jié)及促進炎癥因子表達功能的一種細胞因子，其在由胰島素抵抗而引起的代謝綜合征(MS)患者血清當(dāng)中濃度顯著升高，而胰島素抵抗與AGA緊密聯(lián)系，同時AGA的發(fā)生與MS呈正相關(guān)關(guān)系[20-22]。黃芪、桔梗、墨旱蓮、女貞子可抑制血清中IL-6的產(chǎn)生[23-25]。

3.3 生物功能及信號通路分析

通過對核心靶點進行GO和KEGG富集分析，預(yù)測黃芪首烏酊治療AGA參與了多種生物學(xué)過程、細胞組成、分子功能及信號通路作用，主要涉及上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、對生長因子反應(yīng)(response to growth factor)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)、 PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)等，這些通路可能在黃芪首烏酊治療AGA過程中發(fā)揮著重要作用。Takahashi T[27]通過觀察人頭發(fā)角化細胞增殖試驗說明了成纖維細胞生長因子-7/角質(zhì)形成細胞生長因子(FGF-7/KGF)等因子可刺激上皮成分的增殖和分化，促進毛干的伸長。Shin HS[28]通過分析人參皂苷治療AGA小鼠病理模型的作用機制說明可通過干預(yù)TGF-β轉(zhuǎn)化通路以降低TGF-β2和SCAP蛋白的表達進而控制細胞凋亡抑制AGA持續(xù)發(fā)展。而黃芪也可干預(yù)TGF-β轉(zhuǎn)化通路降低TGF-β的表達，發(fā)揮類似人參皂苷治療AGA的作用[29]。Kim MH[30]通過探索黃芪甲苷對毛囊凋亡信號傳導(dǎo)的潛在機制中發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷 IV 可通過抑制由Fas/Fas L 細胞凋亡途徑觸發(fā)的半胱天冬酶依賴性細胞死亡來延緩自發(fā)性退行期，同時黃芪甲苷減弱了毛發(fā)角質(zhì)形成細胞的終末分化以及生長因子和細胞因子的水平，促進毛發(fā)再生。Zhang L[18]的相關(guān)實驗研究也證實黃芪提取物可激活A(yù)KT/GSK3beta 和 AKT/mTOR 通路和升高VEGF的蛋白質(zhì)表達，有助于毛囊周圍新血管的生成。Zhang X[31]在探究VEGFA是否對AGA患者毛囊干細胞的凋亡產(chǎn)生影響中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子可通過PI3K/Akt途徑保護毛囊干細胞避免受到雄激素誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響。

綜上所述，通過對黃芪首烏酊治療AGA的可視化分析得出，其治療過程呈現(xiàn)出多成分、多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)、非線性的特點，黃芪首烏酊可能通過槲皮素、芒柄花素、7-O-甲基異鼠李糖醇、豆甾醇、山奈酚、木犀草素等有效活性成分作用于VEGFA、EGFR、IL6、AR、AKT1等關(guān)鍵靶點，調(diào)控上皮細胞增殖、對生長因子的反應(yīng)、抑制Fas/Fas L細胞凋亡信號表達、雄激素的分泌代謝、PI3K-Akt 信號通路以及蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等多種生物學(xué)過程、信號通路、分子功能來特異性抑制Ⅱ型5α還原酶或增強鉀離子通道開放以達到抑制睪酮(T)轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮(DHT)、促進頭皮毛細血管增生及毛囊細胞增殖的作用，但黃芪首烏酊治療AGA的作用機制是否和癌癥中的蛋白多糖、炎癥性腸病等通路作用相關(guān)有待相關(guān)實驗的進一步驗證。同時，因為藥物與疾病數(shù)據(jù)庫的不全可能導(dǎo)致對相關(guān)藥物活性成分及疾病靶點篩選出現(xiàn)遺漏；在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對黃芪首烏酊的分析中未考慮到中藥的炮制、劑量及用法可能影響到藥物有效成分及其治療作用導(dǎo)致其出現(xiàn)偏差，因此后期需要進一步開展相關(guān)生物學(xué)實驗對黃芪首烏酊的治療靶點、治療通路進行科學(xué)驗證，為黃芪首烏酊治療AGA提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。