湯承浩，胡秀虹，文廷珊

(凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011)

地參(LycopuslucidusTurcz.)屬唇形科(Labiatae)多年生草本植物，別名蟲草參、地蠶子、草石蠶，因其形狀、營養(yǎng)成分與人參相似而得名。植株主要分布于云南、江西、江蘇、四川、湖南、湖北、貴州等地[1]。地參全草均可以入藥，具有利尿、活血、滋陽、利關(guān)節(jié)同時還有多種生物活性，如增強免疫功能，抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用[2-3]。

楊書良等[4]首先用溫浸的方法提取北豆根中蝙蝠葛堿的含量，接著用滲漉法，最后采用超聲波法，在其他條件不變的情況下對提取率進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取法用時較短，提取率比其他的兩種方法高效。高岐[5]等人運用微波提取金銀花中總黃酮，提取率為2.73%；向極遷等[6]運用超聲法從金銀花中提取總黃酮，提取率高達(dá)8.84%，可見同種植物超聲提取的提取率比較高。劉華等[7]在提取因素不變情況下，同時采用超聲法及微波法，提取韭菜中總黃酮，超聲各個方面均優(yōu)于微波法。郭文娟等[8-10]用超聲方法分別從山楂核、藏藥刀豆、廣豆根中提取總黃酮，與對照品進行比較，黃酮提取液用于清除DPPH·效果較好，清除率越高抗氧化能力越強。植物總黃酮提取含量測定常采用紫外分光光度法[11]，利用黃酮類物質(zhì)可被亞硝酸鈉還原和硝酸鋁絡(luò)合在堿性條件下會顯紅色的性質(zhì)，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，在最大波長處可以測定植物中總黃酮含量。

超聲技術(shù)提取地參總黃酮，工藝簡便、高效、快速、成本低，所用的提取溶劑乙醇較其他工藝用量少。在黃酮研究中選取地參為提取物較少報道，選用價格相對較低的乙醇為提取劑可以降低實驗成本。地參抗氧化劑能有效清除體內(nèi)多余自由基，不但能延緩衰老還能減少和預(yù)防疾病。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

實驗材料選取黔東南州凱里市萬潮鎮(zhèn)培植的地參。采摘時間2016年11月。將新鮮的地參的根部分洗凈，瀝干表面水分，切成小塊，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，設(shè)置溫度80 ℃。干燥好后用粉碎機將其粉碎，過40目篩，作為供試樣品。

1.2 實驗試劑與設(shè)備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所，批號：NACC-60013)、亞硝酸鈉(畢得醫(yī)藥)、硝酸鋁(畢得醫(yī)藥)、氫氧化鈉(畢得醫(yī)藥)、1，1-二苯基-2-2苯肼基自由基(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、VC(上海山浦化工有限公司)、無水乙醇(探索平臺)，實驗用水均為超純水。

電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、小型高速粉碎機(青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司)、分樣篩(湖南長沙思科儀器沙篩廠)、電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)、超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、超純水機(艾柯成都康氏康寧科技有限公司)、紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

2 實驗方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于小燒杯中，加70%乙醇溶液3 mL，用玻璃棒攪拌至完全溶解，再將其轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容，搖勻，得到50 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.2 樣品提取液制備

稱取地參粉末1.0048 g(過40目篩)，置于50 mL錐形瓶中，加入70%乙醇溶液20 mL，蓋上玻璃塞，搖勻。超聲15 min，超聲功率100 W，冷卻抽濾，將濾液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液定容，得到地參提取液，備用。

2.3 檢測波長

取以上蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL和地參提取溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液10 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10 %的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置7 min后，最后加入5%氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻后靜置15 min，以相應(yīng)試劑做空白，用紫外-可見分光光度計在波長200～800 nm之間進行掃描，掃描結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和地參提取液在510 nm處有最大波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于50 mL容量瓶中，分別加入70%乙醇溶液10 mL并加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，靜置6 min；然后加入10%硝酸鋁溶液1 mL，靜置7 min；最后加入5%氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇溶液定容，搖勻后靜置15 min。于510 nm波長處測定吸光度。

2.5 單因素實驗

2.5.1 乙醇濃度的選擇

稱取1.0019 g地參粉末，分別加入不同濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)的乙醇溶液20 mL，超聲功率100 W，時間15 min。

2.5.2 超聲功率的選擇

稱取1.0041 g地參粉末，加入70%的乙醇溶液20 mL，設(shè)置超聲時間15 min，超聲功率分別為100 W、137.5 W、175 W、212.5 W、250 W。

2.5.3 超聲時間的選擇

稱取1.0048 g處理好的地參粉末，加入70%乙醇溶液20 mL，設(shè)置超聲功率175 W，超聲時間分別為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。

2.5.4 料液比的選擇

稱取1.0052 g地參粉末5份，分別加入70%乙醇溶液20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL，超聲功率175 W，超聲時間20 min。

2.6 正交實驗

根據(jù)單因素實驗，得出單個因素最佳水平，為了進一步考察各實驗因素對總黃酮提取率的影響，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲功率(B)、超聲時間(C)、料液比(D)為總黃酮提取率(Y)的評價指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交實驗。

2.7 抗氧化活性研究

2.7.1 DPPH·溶液配制

精密稱取4.4 mg DPPH·粉末置于小燒杯中，溶解后轉(zhuǎn)到100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，避光保存，備用。

2.7.2 樣品提取液配制

配制方法與2.7.1相似，將提取液稀釋為0.1924 mg·mL-1，避光保存，備用。

2.7.3 VC溶液配制

精密稱取48.1 mg VC粉末，置于小燒杯中，加入3 mL無水乙醇攪拌溶解。將其轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。精密移取1 mL置于25 mL容量瓶中用無水乙醇定容，搖勻，避光保存，備用。

2.7.4 地參總黃酮對DPPH·清除作用的研究

方法參考了文獻(xiàn)[8-10]。提前準(zhǔn)備好10 mL棕色容量瓶，第一瓶加入5 mL DPPH·，第二瓶加入地參提取液及DPPH·，第三瓶加入地參提取液，分別用無水乙醇定容。按照此法加入DPPH·體積不變，地參提取液依次加入量為1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL。無水乙醇作為空白，在517 nm處分別測定DPPH·(A0)，DPPH·加地參提取液(A1)，以及加入的地參提取液(A2)吸光度值。算出清除率。

2.7.5 VC對DPPH·清除作用的研究

同等體積地參提取液溶液換成VC，依次算出不同濃度下VC對DPPH·的清除率，再和地參提取液做比較。

DPPH·清除率公式：DPPH·清除率(%)=[A0-(A1-A2)/A0]×100%

A0：DPPH·+無水乙醇；

A1：地參提取液+DPPH·；

A2：地參提取液+無水乙醇。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，測得的吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，蘆丁在0.04～0.10 mg·mL-1之間線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

3.2 單因素實驗

3.2.1 乙醇濃度的影響

由圖2可以看出，乙醇濃度從50%增長到70%，提取率增高，乙醇濃度為70%時達(dá)到最大值；繼續(xù)增加乙醇濃度，提取率迅速下降。從成本和提取量來考慮，乙醇濃度最好控制在70%左右。

圖2 不同乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on theextraction rate of total flavonoids

3.2.2 超聲功率的影響

從圖3可見，超聲功率在100 W到175 W時提取率逐漸提高，隨后功率增大提取率漸漸降低。可見功率太低不能將所需成分提取出來；而功率過高則會破壞有效成分，由此選取功率175 W為宜。

圖3 不同超聲功率對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic power on theextraction rate of total flavonoids

3.2.3 超聲時間的影響

從圖4可見，從超聲10 min開始每間隔5 min提取率上升，20 min后提取率逐漸下降，可見超聲時間太短無法提取出黃酮類化合物；時間過長導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)被破壞，因此選擇超聲時間20 min相對較好。

圖4 不同超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on theextraction rate of total flavonoids

3.2.4 料液比的影響

料液比對地參總黃酮提取率的影響如圖5所示，在料液比為1∶30 g·mL-1時，地參總黃酮提取率最好，當(dāng)料液比小于1∶30 g·mL-1時，活性物質(zhì)不能完全被析出；當(dāng)料液比大于1∶30 g·mL-1后，提取率逐漸下降。綜合提取效果和減少溶劑用量等方面考慮，選取料液比1∶30 g·mL-1較合適。

圖5 不同料液比對總黃酮提取率影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

3.3 正交實驗

選擇的因素見表1，組成的正交實驗見表2。

表1 正交實驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果Tab.2 L9(34) orthogonal test results

續(xù)表2

由表2可看出，各個因素對地參總黃酮提取率的影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時間>超聲功率。得到的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %、超聲功率175 W、超聲時間20 min、料液比1∶30 g·mL-1，此條件下平行測定三次，提取率為96.25 mg·g-1。

3.4 抗氧化活性研究

比較相同體積濃度下地參提取液及VC對DPPH·的影響，見圖6。

圖6 總黃酮及VC對DPPH·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of total flavonoids and Vc on DPPH·

由圖6可知，在以上選定濃度范圍內(nèi)，地參總黃酮濃度越高，清除能力越強，與VC相比，通過回歸方程可以計算出地參總黃酮IC50=0.00272 mg·mL-1；VC的IC50=0.00455 mg·mL-1，地參總黃酮提取液對DPPH·表現(xiàn)出較強的清除能力，地參提取液對DPPH·的清除能力強于VC。

4 結(jié)論與討論

本實驗研究利用超聲法提取地參總黃酮化合物工藝并對其體外抗氧化活性進行測試。考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時間、料液比四個因素對總黃酮提取率的影響，通過正交實驗得出最佳提取工藝，并采用DPPH·法對地參總黃酮的自由基清除能力和總抗氧化活性進行評價。結(jié)果表明：地參總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲功率為175 W，超聲時間為20 min，料液比為1∶30?？傸S酮提取率高達(dá)96.25 mg·g-1。且超聲提取法得到的地參提取物對DPPH·有很好清除作用，IC50值為0.00272 mg·mL-1。