陳永剛 黃剛

陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院1輸血科，2檢驗科（陜西咸陽712000）

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）是指由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致的以肝臟局部慢性炎性損傷為主的慢性感染性疾?。?-2］，我國為高發(fā)國家，且隨著社會的發(fā)展，CHC 的發(fā)病率呈逐年上升趨勢［3-4］。研究表明，感染HCV 后，若未得到及時有效的治療，病情可進一步進展為肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌，嚴重威脅患者的生命健康［5］。肝纖維化為CHC 進展為肝硬化的病理過程，因此早期診斷患者肝纖維化程度對診治CHC及評估預后具有十分重要的臨床意義。目前，肝纖維化診斷的金標準為肝臟活體組織穿刺，該式雖具有較高的靈敏度和特異度，但活體組織穿刺具有創(chuàng)傷性，患者疼痛感強烈，這也導致該方法難以動態(tài)監(jiān)測患者病情的變化［6-7］。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小RNA 分子，主要通過直接靶向結合于特定信使RNA3'端的非編碼區(qū)進而起到降解該信使RNA 或抑制其蛋白反應的負向調(diào)控作用［8-9］。近年來，已有大量研究證實，miRNA 可作為生物標志物用于疾病的診斷及預后評估［10］。既往已有研究證實，miR-134 和miR-301 表達與HCV感染存在密切聯(lián)系，并在HCV 感染病毒增殖過程中發(fā)揮著重要作用，這也為臨床上診斷及評估CHC 病情提供新的思路［11-12］?；诖耍狙芯客ㄟ^探討血清miR-134 及miR-301 水平對慢性丙型肝炎肝纖維化的診斷價值，旨在為臨床上診治慢性丙型肝炎肝纖維化提供相關依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2020年2月至2021年2月我院收治的150 例CHC 患者為CHC 組。同期選擇150 例體檢健康（常規(guī)體檢項目：血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖、胸片、血壓、血脂、血糖）人群為對照組。所有研究對象及其家屬知情且同意。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入排除標準 CHC 組納入標準：（1）符合2019年中華醫(yī)學會肝病分會制定的《丙型肝炎防治指南》相關診斷標準［13］；（2）年齡≥18 歲；（3）完成肝臟活體組織穿刺檢查。對照組納入標準：（1）近1 個月內(nèi)體檢正常者；（2）年齡≥18 歲。排除標準：（1）合并其他病毒性肝炎或感染性疾病者；（2）患有肝臟腫瘤、脂肪肝等其他類型肝臟疾病者；（3）合并其他嚴重臟器疾病者；（4）近3 個月服用免疫抑制劑等；（5）依從性差者。

1.3 方法 所有研究對象于入組時采用真空干燥管、EDTA-K2 抗凝靜脈血各抽血5 mL，分離血清及血漿供后續(xù)試驗。采用全自動生化分析儀（7600-310，日立）檢測研究對象丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）水平。采用RNA 提取試劑盒（TAKARA 公司，日本）提取外周全血RNA，并根據(jù)反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，根據(jù)SYBR RT-PCR 試劑盒（中國杭州博日科技有限公司）說明書進行RT-PCR實驗。反應體系為：95 ℃預變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，循環(huán)35 次。采用2-ΔΔCt法來測定各組miR-134 和miR-301 相對表達量，內(nèi)參為U6，每個樣本重復三次，取平均值。引物由中國北京鼎國生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

CHC 組進行肝組織活體穿刺檢查，并對患者肝纖維化程度進行判定［14］：無纖維化，S0；擴大的匯管區(qū)纖維化，S1；匯管區(qū)周圍纖維化，S2；匯管區(qū)周圍纖維化但小葉結構保留，S3；纖維化并伴有小葉結構紊亂，S4。

1.4 觀察指標 （1）比較CHC 組及對照組ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平；（2）ROC 曲線分析ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平在診斷顯著性肝纖維化（S2-S4 期）中的臨床價值；（3）比較不同程度肝纖維化患者ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。ROC 曲線分析ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平在診斷顯著性肝纖維化（S2-S4 期）中的臨床價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CHC 組及對照組一般資料比較 CHC 組及對照組在年齡、性別等資料上比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），而在ALT、AST 及TBIL 上比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 CHC 組及對照組一般資料比較Tab.2 Comparison of general information between CHC group and control group ±s

表2 CHC 組及對照組一般資料比較Tab.2 Comparison of general information between CHC group and control group ±s

指標年齡（歲）性別［例（%）］男女ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）CHC 組（n=150）55.2±8.9 81（54.00）69（46.00）122.31±18.95 137.83±20.56 18.72±3.51對照組（n=150）54.7±9.2 84（56.00）66（54.00）25.62±9.93 24.47±6.54 7.51±2.35 t/χ2值0.478 0.121 55.352 64.351 32.503 P 值0.633 0.728＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 CHC 組及對照組miR-134、miR-301 水平比較 相較于對照組，CHC 組miR-134、miR-301 水平更高（P＜0.01），見表3。

表3 CHC 組及對照組miR-134、miR-301 水平比較Tab.3 Comparison of miR-134 and miR-301 levels between CHC group and control group ±s

表3 CHC 組及對照組miR-134、miR-301 水平比較Tab.3 Comparison of miR-134 and miR-301 levels between CHC group and control group ±s

組別CHC 組對照組t 值P 值例數(shù)150 150 miR-134 5.89±1.91 2.25±1.07 20.363＜0.001 miR-301 7.60±2.61 2.76±1.34 20.204＜0.001

2.3 CHC 組不同肝纖維化程度患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平比較 隨著肝纖維化分期的上升，患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平也有所上升（P＜0.05），見表4。

表4 CHC 組不同肝纖維化程度患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平比較Tab.4 Comparison of ALT、AST、TBIL、miR-134 and miR-301 levels in patients with different liver fibrosis in CHC group ±s

表4 CHC 組不同肝纖維化程度患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平比較Tab.4 Comparison of ALT、AST、TBIL、miR-134 and miR-301 levels in patients with different liver fibrosis in CHC group ±s

注：a，與S0 組比較，P ＜0.05；b，與S1 組比較，P ＜0.05；c，與S2 組比較，P ＜0.05；d，與S3 組比較，P ＜0.05

組別S0 S1 S2 S3 S4 F 值P 值例數(shù)30 51 24 24 21 miR-134 4.11±0.89 5.14±0.93a 5.97±0.94ab 7.39±0.91abc 8.22±0.36abcd 88.027＜0.001 miR-301 4.24±1.03 5.91±0.96a 7.33±1.24ab 8.87±1.01abc 9.95±0.47abcd 132.352＜0.001 ALT（U/L）116.43±11.24 121.98±10.13a 126.09±8.83ab 133.45±9.21abc 138.13±9.09abcd 19.938＜0.001 AST（U/L）129.44±13.95 134.17±11.08a 140.92±10.56ab 145.21±7.73abc 150.39±7.18abcd 15.768＜0.001 TBIL（μmol/L）13.34±2.25 16.71±2.09a 20.12±1.88ab 23.45±2.31abc 26.67±2.25abcd 74.356＜0.001

2.4 ROC 曲線結果 ROC 曲線結果顯示，當miR-134 截斷值為4.827 時，其診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.825；當miR-301 截斷值為9.069 時，其診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.775；ALT 截斷值為121.51 U/L 時，其診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.604；AST 截斷值為132.62 U/L 時，其診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.573；TBIL 截斷值為18.69 μmol/L 時，診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.618。見表5 和圖1。

圖1 miR-134 和miR-301 診斷顯著性肝纖維化的ROC 曲線圖Fig.1 ROC curve of miR-134 and miR-301 in the diagnosis of significant liver fibrosis

表5 ALT、AST、TBIL、miR-134 和miR-301 診斷顯著性肝纖維化的ROC 曲線結果Tab.5 ROC curve results of ALT、AST、TBIL、miR-134 and miR-301 in the diagnosis of significant liver fibrosis

3 討論

CHC 在發(fā)展過程中往往伴有肝細胞慢性壞死以及肝纖維化，對患者生命健康帶來嚴重危害［15］。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，無創(chuàng)診斷模型診斷疾病成為醫(yī)學研究者關注的熱點。但多數(shù)模型涉及的參數(shù)往往為非常規(guī)臨床檢驗項目，導致這一類模型難以廣泛運用于臨床診斷中［16-17］。近年來，已有大量研究證實，miRNA 可參與近1/3 的基因調(diào)控，在肝細胞的增殖、分化等過程中起著重要作用［18-19］。此外，miRNA 在血清中性質(zhì)穩(wěn)定，檢測方式簡便，為肝臟相關疾病的診斷、病情評估提供可能。

miR-134 位于人14 號染色體上。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-134 及其同簇的miRNA 在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用［20］。肝纖維化以及肝癌進展過程中，失調(diào)的轉錄因子肝細胞核因子1a 可對miR-134 進行調(diào)控，從而抑制肝臟腫瘤的惡性表型。本研究結果顯示，相較于正常人群，CHC 患者miR-134 水平顯著上升。筆者進一步發(fā)現(xiàn)，隨著CHC 患者肝纖維化程度的增加，患者miR-134 水平也有所上升。這提示miR-134 可能參與CHC 的發(fā)生發(fā)展過程，其水平的變化在一定程度上可反映患者的疾病嚴重程度，為CHC 疾病的評估提供了相關依據(jù)。

miR-301 位于人體第17 號染色體上，既往已有研究證實，miR-301 可參與腫瘤細胞的生長。研究表明，miR-301 在肝細胞癌中呈過表達，并能參與肝癌細胞的增殖、凋亡、遷徙、侵襲等過程，與肝癌的預后密切相關［21］。本研究結果顯示，相較于正常人群，CHC 患者miR-301 水平也有所上升。且與miR-134 一致，miR-301 水平隨著CHC 患者肝纖維化程度的增加而呈上升趨勢，并在一定程度上可反映患者的疾病嚴重程度。

目前，臨床上診斷顯著性肝纖維化方式主要為肝活檢，該術為有創(chuàng)性，部分患者難以接受，因此探討安全性更高且有效的生物標志物十分必要。筆者進一步通過ROC 曲線分析了ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 在診斷顯著性肝纖維化中的臨床價值。結果顯示，當ALT、AST、TBIL 在診斷顯著性肝纖維化中臨床價值一般。而miR-134截斷值為4.827 時，其診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.825，靈敏度為0.934，而特異度為0.871；當miR-301 截斷值為9.069 時，其診斷顯著性肝纖維化的AUC 為0.775，靈敏度為0.826，特異度為0.922，提示miR-301、miR-134檢測可獲得較高的診斷價值。

但本研究也存在以下不足：（1）未進一步隨訪患者預后，難以分析上述指標在評估患者預后中的臨床價值；（2）未與其他類型肝炎病毒感染疾病相比較，以分析上述指標的特異性。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者血清miR-134 及miR-301 水平顯著上升，并與患者肝纖維程度密切相關。miR-134 及miR-301 聯(lián)合檢測在診斷顯著性肝纖維化中具有一定臨床價值。