劉立 李俊義 劉春云 常麗仙 劉紅明 黃紅麗 羅煜 高建鵬

1昆明市第三人民醫(yī)院（云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學中心）（昆明650041）；2 昆明醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年科（昆明650000）

【關健詞】 肝爽顆粒； 恩替卡韋； 乙型肝炎肝硬化； D-二聚體； 高凝狀態(tài)； 門靜脈血栓

乙型肝炎肝硬化（hepatitis B cirrhosis，HBC）是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）發(fā)展的較嚴重的階段，HBC 的并發(fā)癥較多，且抗病毒治療的療效仍不令人滿意，預后極差，嚴重的甚至出現(xiàn)肝癌或死亡［1］。據(jù)調(diào)查，2009-2016年期間，由肝硬化造成的年病死率從10.5%升高到20.0%［2］。盡管隨著我國乙肝疫苗接種的普及，新的CHB 的發(fā)病率大大下降，但我國CHB 的絕對人口數(shù)量仍然巨大，因此目前HBC 仍然極為常見。我國HBC 約占全部肝硬化病例的66.7%～75%［3］。HBC 患者存在不同程度的凝血功能障礙及纖維蛋白溶解系統(tǒng)異常。其中，D-二聚體（D-dimer，D-D）［4］是纖維蛋白單體經(jīng)過活化因子的交聯(lián)后，再經(jīng)纖溶系統(tǒng)中的纖溶酶進行水解反應所產(chǎn)生的纖維蛋白特異性降解物，當體內(nèi)D-D 的水平升高，表明體內(nèi)繼發(fā)性纖維的活性明顯增強，因此D-D 是體內(nèi)發(fā)生凝血障礙以及纖溶系統(tǒng)遭到破壞的標志物［5］。D-D 水平的升高也是非腫瘤性門靜脈血栓形成（portal vein thrombosis，PVT）的危險因素［6］，特別是在病情比較嚴重的失代償期肝硬化患者，D-D 水平的升高比較常見。而抗凝治療盡管能降低PVT 的發(fā)生率［7］，但僅適用于肝儲備功能相對好、凝血功能及血小板水平相對較好、既往未發(fā)生過出血的患者［8］，而失代償期的患者抗凝治療對此效果很差，且存在出血的風險。部分中藥中的有效成分具有抗炎、抗氧化應激、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化、降低門靜脈壓力等作用，具有多途徑、多靶點且不良反應少等優(yōu)點。有研究表明［9］，肝爽顆粒（Ganshuang granule，GS）組方中的君藥黨參的主要提取物可以通過抑制VWF 信號級聯(lián)的絲氨酸-蘇氨酸激酶效應物Lyn 激酶，降低D-D濃度、血小板活化標記物CD41 濃度和血栓素A2 血清濃度，有效地防止缺氧誘導的血小板活化和由此產(chǎn)生的促凝狀態(tài)，但尚缺乏臨床的數(shù)據(jù)支持?；诖耍狙芯客ㄟ^觀察GS 聯(lián)合恩替卡韋（Entecavir，ETV）對HBC 患者D-D 的影響，以期為臨床提供必要的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月1日至2020年12月31日來昆明市第三人民醫(yī)院就診的門診及住院的HBC 患者共371 例，其中男261 例，女110 例，年齡18 ～74 歲，平均年齡48.83 歲。納入標準：（1）D-D 水平升高；（2）符合肝硬化的診斷標準［10］；（3）HBsAg 陽性超過半年、HBV DNA 陽性；（4）入組前半年內(nèi)無抗病毒治療史；（5）隨訪時間超過半年。排除標準：（1）合并可以引起血漿D-D 水平升高的其他疾病，如惡性腫瘤、心腦血管性疾病、原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病等；（2）半年內(nèi)使用抗凝或促凝藥物；（3）合并其他嗜肝病毒感染、藥物性、酒精性、中毒性、遺傳代謝性、自身免疫性肝病等肝臟疾??；（4）肝癌；（5）妊娠及哺乳期婦女；（6）已診斷PVT 或其他部位栓塞者；（7）有脾臟切除術史、脾臟栓塞術史、分流術史或TIPS 術史等；（8）有恩替卡韋或肝爽顆粒使用禁忌癥；（9）隨訪不足半年者或三個月內(nèi)死亡者。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審查批準（NO：昆三倫20170115）。所有患者均由本人或監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 研究方法 觀察組中男133 例，女58 例，年齡18 ～74 歲，平均48.29 歲；對照組中男118 例，女47例，年齡19 ～73歲，平均49.45歲。收集患者的基線指標，后每3個月檢測一次。必要時增加相關檢測。

每3 個月隨訪一次，以患者在本院的連續(xù)隨訪記錄滿12個月為隨訪終點。以基線、隨訪6個月、隨訪12 個月為主要觀測時間點。計算患者在隨訪期間應用GS的累計日劑量（cumulate defined daily doses，cDDD）。服用GS≥180 cDDD的患者歸為觀察組。

1.3 治療方法 所有患者均根據(jù)病情需要酌情給予安體舒通、呋塞米、白蛋白、血漿等常規(guī)對癥支持治療。在此基礎上，按照隨機分組的原則，將患者隨機分為GS 聯(lián)合ETV 分散片組（觀察組）199 例和單用ETV 組（對照組）172 例。服用GS 和/或ETV時間超過半年。ETV 為0.5 mg/次，口服，1日1 次。GS 為3 g/次，1日3 次。最終資料完整者觀察組191 例、對照組165 例。

GS 為保定天浩制藥有限公司生產(chǎn)，3 克/袋，12袋/盒（生產(chǎn)批號：20180102）；ETV 為湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，0.5 mg/片，14 片/盒（生產(chǎn)批號：20171230）。

1.4 檢測儀器設備及試劑 血漿D-D 水平檢測在治療前、治療后每3 個月檢測一次，空腹抽取研究對象靜脈血1.8 mL，109 mmol/L 枸櫞酸鈉0.2 mL 抗凝，3 000 r/min 離心，10 min 后分離血漿，取血漿在日本希森美公司生產(chǎn)的Sysmex CA-7000 全自動凝血分析儀上進行D-D 檢測，采用免疫比濁法，試劑盒由Sysmex 公司提供。

臨床生化檢測使用日本奧林巴斯AU400 全自動生化儀（Japan，Olympus Optical Industry Co.，Ltd.）。外周血檢測采用Sysmex-XT 4000i 全自動血細胞分析儀檢測（Japan，Sysmex Corporation）。B超使用荷蘭邁德彩色多普勒超聲診斷設備和支持系統(tǒng)（Netherlands，Royal Dutch Philips Electronics Ltd.）。HBV-M 檢測采用ROCHE 公司e601 全自動電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（Switzerland，Roche Diagnostics Products CO.，Ltd），試劑購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司的配套試劑（HBsAg 的稀釋采用HBsAg-QN Dil HepB 在相應的平臺強制稀釋）。cobas HBV DNA 檢測用ROCHE 公司全自動AmpliPrep/cobas TaqMan 48 系統(tǒng)檢測儀，試劑使用ROCHE 公司的配套試劑（Switzerland，Roche Diagnostics Products CO.，Ltd），線性檢測范圍為2 ×101～1.7 × 108IU/mL。肝硬度采用法國ECHOSENS FIBROSCAN 儀器（France，ECHOSENS Co.，Ltd）進行肝硬度值（LSM，KPA）檢測。CT 使用美國GE 公司64 排lightspeed VCT 機、AW4.3 工作站、perfusion-3.0 灌注軟件包獲得圖像（the United States，General Electric Company）。MRI 使用上海聯(lián)影3.0T 核磁共振成像系統(tǒng)-uMR780 進行掃描（China，Shanghai Lianying Medical Technology Co.，Ltd）。

1.5 統(tǒng)計學方法 使用EXCEL 表格收集原始資料，采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；非正態(tài)分布的計量資料用M（P25，P75）進行描述，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗。兩組的D-D 水平分布符合正態(tài)分布，采用重復測量方差分析，采用Greenhouse-Geisser 法進行校正。當交互作用有統(tǒng)計學意義時進一步進行簡單效應分析，組內(nèi)各時間點之間的比較采用Bonferroni 法進行比較。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基線情況 基線時Child-Pugh 分級［8］：觀察組B 級99 例，C 級92 例，對照組：B 級78例，C 級87 例，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 0.736，P = 0.391）；基線時肝硬化并發(fā)癥：觀察組自發(fā)性腹膜炎10 例、腹水17 例、肝性腦病2例、肝腎綜合征6 例、上消化道出血4 例，對照組自發(fā)性腹膜炎8 例、腹水12 例、肝性腦病1 例、肝腎綜合征5 例、上消化道出血4 例，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.340，P=0.987）；基線時合并高血壓：觀察組22 例，對照組17 例，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.134，P=0.714）；基線時合并糖尿?。河^察組18 例，對照組18 例，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 0.215，P = 0.643）。兩組在性別、年齡、BMI、肝腎功能、D-D 等基線指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者的基線特征Tab.1 Baseline characteristics of the two groups of patients M（P25，P75）

2.2 兩組患者在治療前、治療6、12個月D-D水平分析 經(jīng)S-W檢驗，各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布。重復測量數(shù)據(jù)的球形檢驗結(jié)查顯示，MachlyW=0.645，顯著性P＜0.001，不符合球形檢驗。因此以一元方差分析“Greenhouse-Geisser”中的校正結(jié)果為準。重復測量方差分析結(jié)果顯示：兩組間的主效應顯著，F(xiàn)=58.953，P＜0.001，偏η2=0.143；時間的主效應顯著，F(xiàn)=545.167，P＜0.001，偏η2=0.606；時間與組別的交互效應顯著，F(xiàn)=10.117，P＜0.001，偏η2=0.028。表明兩組之間差異有統(tǒng)計學意義、每組內(nèi)三次D-D 水平間差異有統(tǒng)計學意義，同時組別和治療時間存在交互作用。見表2。

表2 組別和時間對乙肝肝硬化患者D-二聚體水平的影響Tab.2 Effects of group and time on the level of D-dimer in patients with hepatitis B cirrhosis ±s

表2 組別和時間對乙肝肝硬化患者D-二聚體水平的影響Tab.2 Effects of group and time on the level of D-dimer in patients with hepatitis B cirrhosis ±s

注：a，交互效應

觀察組對照組組別主效應時間主效應組別*時間a n 191 165基線3.44±1.33 3.59±1.30治療6 個月1.70±0.65 2.44±0.88治療12 個月1.09±0.40 1.63±0.62重復測量F 檢驗F 值58.953 545.167 10.119 P 值＜0.001＜0.001＜0.001偏η2 0.143 0.606 0.028

2.3 組別因素和時間因素的分別分析 組別因素的簡單效應和時間因素的簡單效應組別的簡單檢驗效應結(jié)果顯示：在干預前，兩組間D-D 水平之間的簡單效應不顯著，F(xiàn)=1.130，P=0.289，偏η2=0.003；在治療6 個月時兩組的D-D 水平的簡單效應顯著，F(xiàn)=82.716，P＜0.001，偏η2=0.189；在治療12 個月時兩組的D-D 水平的簡單效應顯著，F(xiàn)=97.181，P＜0.001，偏η2=0.215。見表3。

表3 固定時間因素兩個組別之間的比較Tab.3 Comparison between two groups at the same levels of time factor

時間的簡單效應結(jié)果顯示：在觀察組中，基線時、治療6 個月和治療12 個月比較，時間因素的簡單效應有統(tǒng)計學意義（F=288.459，P＜0.001）；在對照組中，基線時、治療6 個月和治療12 個月間比較，時間因素的簡單效應亦有統(tǒng)計學意義（F= 207.913，P＜0.001）。觀察組中基線、治療6 個月和治療12 個月的D-D 水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；對照組中基線、治療6 個月和治療12 個月的D-D 水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。見表4。

表4 時間因素不同水平的多重比較Tab.4 Multiple comparison among the levels of time factor

2.4 治療時間與組別之間的交互輪廓圖 治療時間與組別間的交互輪廓圖直觀地反應了治療時間與組別之間存在的交互效應。見圖1。

圖1 時間因素與組別因素的交互輪廓圖Fig.1 Profile plot of time and grouping factors

2.5 兩組患者的并發(fā)癥和病死率情況 在對兩組患者的藥物治療及抗病毒治療的過程中，兩組之間的新發(fā)腹水的發(fā)生率分別為4.19%、10.30%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.024）；新發(fā)的原發(fā)性自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生率分別為1.57%、4.24%，差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.128）；新發(fā)的上消化道出血的發(fā)生率分別為1.05%、4.85%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.030）；新發(fā)的PVT 的發(fā)生率分別為4.71%、10.30%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.043）；死亡率分別為0.52%、1.21%，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.482）。見表5。

表5 兩組患者的并發(fā)癥及病死率情況比較Tab.5 Comparison of complications and mortality between the two groups 例

兩組患者鼻出血發(fā)生率分別為2.09%、3.64%、牙齦出血發(fā)生率分別為1.57%、3.03%、皮膚出血發(fā)生率分別為1.05%、1.82%、便血發(fā)生率分別為1.05%、2.42%。

2.6 兩組患者凝血功能的變化 收集到兩組患者基線和治療后的凝血功能指標，兩組患者PT、APTT 治療前后的差值的均值比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.223，P＜0.001；t=5.910，P＜0.001）；而TT、INR 治療前后的差值的均值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表6。

表6 兩組患者治療前后凝血功能比較Tab.6 Comparison of blood function between the two groups before and after treatment ±s

表6 兩組患者治療前后凝血功能比較Tab.6 Comparison of blood function between the two groups before and after treatment ±s

觀察組對照組t 值P 值PT（s）治療前24.93±4.39 25.25±4.80治療后18.45±4.01 21.32±4.12差值的均值6.48±1.41 3.93±1.48 4.223＜0.05 APTT（s）治療前56.17±10.75 55.89±10.52治療后45.67±8.24 50.52±8.59差值的均值10.5±1.89 5.37±1.79 5.91＜0.05 TT（s）治療前25.36±5.31 25.13±5.25治療后22.47±4.05 23.68±4.35差值的均值2.89±0.48 1.45±0.50 1.028 0.305 INR治療前1.61±0.44 1.67±0.46治療后1.35±0.31 1.46±0.43差值的均值0.26±0.04 0.21±0.05 1.14 0.255

3 討論

本研究表明，HBC 患者單用ETV 與ETV 聯(lián)用GS 治療12 個月，均能有效的降低D-D 水平，且隨著治療時間的延長，D-D 水平降低越明顯。同時，在各時間點上，ETV 聯(lián)用GS 比單用ETV 降低D-D的幅度更明顯，且PVT、腹水和消化道出血的發(fā)生率更低。

HBC 失代償期患者的出血功能和凝血功能均明顯異常，可能出現(xiàn)消化道出血、PVT 等嚴重并發(fā)癥，患者死亡率極高，預后較差［11-12］。D-D 水平不同程度的升高，是肝硬化患者PVT、感染等的高危因素。研究顯示，血漿D-D 水平升高與肝硬化患者CHILD-PUGH 分級和MELD 評分具有明顯的正相關性，MELD 評分＞15 的患者其D-D 水平明顯高于評分≤15 的患者，表明D-D 水平越高，肝硬化病情越重，病死率越高［13-15］。術前高D-D 水平也是腹部手術后門靜脈血栓形成和預后不良的高危因素［16-17］。

本研究顯示，對照組使用ETV6 個月和12 個月時，D-D 水平逐漸下降，表明ETV 可能通過抑制肝細胞炎癥活動、修復肝內(nèi)血管內(nèi)皮細胞損傷等，從而發(fā)揮改善肝臟血流動力學的作用，最終達到改善肝臟功能障礙［18］，糾正HBC 失代償所致的高凝狀態(tài)，減少PVT 的風險。而觀察組使用ETV 聯(lián)合GS 治療6 個月和12 個月時，D-D 比單用ETV 各時間點下降更明顯，表明GS 在修復損傷的肝細胞、改善門靜脈壓力、緩解高凝狀態(tài)等方面發(fā)揮了明顯的作用。特別是組別的簡單檢驗效應和時間的簡單檢驗效應均有顯著性差異，表明GS 在減輕HBC 患者高凝狀態(tài)、修復肝細胞功能方面具有顯著的作用。顯示出聯(lián)合治療能在更短時間內(nèi)更成功地影響HBC 患者的出凝血狀態(tài)和肝臟門靜脈血流動力學，甚至可能改善HC 的組織學或逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

GS 組方以柴胡、黨參為君藥，白術、當歸、丹參、虎杖為臣藥，茯苓、白芍、桃仁、鱉甲、蒲公英、夏枯草、枳殼為佐藥。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷能明顯降低肝纖維化大鼠透明質(zhì)酸、層黏蛋白和Ⅵ型膠原含量［19］。黨參提取物的主要活性成分黃酮類可以降低D-D 濃度、有效地防止缺氧誘導的血小板活化和產(chǎn)生的促凝血狀態(tài)［9，20］。而丹參的主要活性成分丹參酮參酮Ⅱ-A、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參單體IH764-3 能改善血液流變學障礙、血管內(nèi)皮功能、抑制血小板聚積和粘附等，從而多途徑改善高凝狀態(tài)［21］。白術內(nèi)酯化物減少激動劑誘導的血小板聚集和降低三磷酸腺苷從致密顆粒中釋放，從而抑制血小板活化［22］。有研究證實，GS 的主要活性成分經(jīng)高效液相色譜分析鑒定為柚皮苷，而柚皮苷可以誘導自噬的激活，減輕肝細胞損傷，還可能通過MTOR 途徑抑制HSC 活化，從而達到抗纖維化的作用［23］。LU 等的研究［24］證實，ETV 聯(lián)合GS 能更多的改善CHB 引起的晚期纖維化和HBC 肝組織學。也有學者發(fā)現(xiàn)，GS 組的白細胞介素6、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β 的表達水平更高，而轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的表達則下降，GS 可能通過部分抑制調(diào)節(jié)性T 細胞分化發(fā)揮重要的抗纖維化作用，這有助于肝臟再生和修復［25］。劉立等［26］觀察到，GS 聯(lián)合富馬酸替諾福韋酯能更好地改善HBC 的門靜脈血流動力學指標如DPV、VPV、QPV 等?？梢?，GS 的活性成分可能通過誘導激活自噬、抑制HSC 活化、抑制調(diào)節(jié)性T 細胞分化、改善血管內(nèi)皮功能、抑制血小板聚積和粘附、改善肝內(nèi)微循環(huán)、提高門靜脈系統(tǒng)血流速度等多靶點影響肝臟組織學和血流動力學狀態(tài)，從而改善HBC 的高凝狀態(tài)、降低D-D 水平。盡管如此，GS在不聯(lián)合抗病毒藥物的情況下對HBC 患者是否能夠有效改善肝臟纖維化和血流動力學狀態(tài)尚需要更多的證據(jù)來證實。

兩組間新發(fā)腹水、上消化道出血和PVT 的發(fā)生率有明顯差別亦表明血流動力學、門靜脈壓力和纖維化的改善聯(lián)合組優(yōu)于對照組。新發(fā)的原發(fā)性自發(fā)性腹膜炎和死亡的發(fā)生率兩組間沒有差別，表明兩組在減少細菌感染方面類似。在減少死亡方面，觀察組出現(xiàn)1 例死亡，對照組出現(xiàn)2 例死亡，由于絕對數(shù)少，可能還需要更多的數(shù)據(jù)或更長時間的觀察。

本研究的局限為單中心的數(shù)據(jù)，需要更多的中心予以證實。

總之，本研究結(jié)果顯示GS 聯(lián)合ETV 對HBC 高凝狀態(tài)的患者D-D 的降低作用顯著，對于HBC 患者PVT 有明顯的預防作用。特別是對臨床上肝功能失代償、有PVT 高風險且抗凝藥物禁忌癥的患者，GS 具有一定的優(yōu)勢，也避免了抗凝藥物引起的出血等風險，值得在臨床中進一步推廣應用。下一步有必要對GS 聯(lián)合ETV 治療HBC 患者的PVT 的遠期發(fā)生率、死亡率進行深入的追蹤研究。