王賽鳳 史蔚 謝咸晶

上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院，上海市胚胎源性疾病重點實驗室婦科（上海200030）

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率和病死率高，是婦科惡性腫瘤之一［1-2］。RNA 結合蛋白家族中RNA 結合基序5（RBM5）是目前公認的抑癌基因［3-4］。既往研究表明RBM5 在多種腫瘤中表達異常，可影響腫瘤進展［5-7］。然而，目前RBM5 在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未見相關報道。CRISPR/Cas9 基因編輯技術能夠快速高效的進行基因敲除，操作簡便、成本較低［8-9］。因此本研究通過CRISPR/Cas9 技術敲除子宮內(nèi)膜癌細胞中RBM5 基因，并初步探究其對子宮內(nèi)膜癌的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、KLE、RL95-2、Hec-1A 和Hec-1B 親本株均來自于上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院。主要試劑與儀器：PX459-puro 和pLVX-Teton 載體均來自復旦大學生命科學院。細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM、雙抗（青霉素-鏈霉素）（Gibco）；Trizol（Invitrogen）；嘌呤霉素、Neofect（MCE 公司）；高保真PCR 酶試劑盒和重組試劑盒（Vazyme Biotech 公司）；抗RBM5 抗體（Proteintech 公司）；抗GAPDH 抗體和辣根酶標記山羊抗兔IgG（CST 公司）；PCR 儀和實時定量PCR 儀（ABI StepOnePlus）；酶標儀（Molecular Devices 公司）；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。本研究倫理審批號為國科倫委（GKLW）2020-03。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設計和CRISPR/Cas9重組載體構建通過synthego 網(wǎng)站（https：//ww.synthego.com/prod？cts/bioinformatics/crispr-design-tool）設計靶向RBM5的三組特異性sgRNA，如表1 所示，由上海捷瑞生物公司合成和構建載體。

表1 靶向RBM5 基因的sgRNA 序列Tab.1 The sequence of sgRNA targeting RBM5 gene

1.2.2 構建RBM5 基因敲除細胞株 將Ishikawa細胞株鋪到6孔板中，待細胞生長匯合度達到60%，利用Neofect 轉(zhuǎn)染試劑體系轉(zhuǎn)染細胞，分別利用Trizol、SDS 和基因組DNA 抽提試劑盒來收取細胞總RNA、總蛋白和基因組DNA。

1.2.3 RBM5 基因敲除驗證Western Blot 和qRTPCR 法分析RBM5 基因表達 細胞基因組DNA由上海邁浦生物公司進行Sanger 測序。

1.2.4 回復株構建 利用慢病毒感染技術和多西環(huán)素（DOX，doxycycline）重新誘導RBM5 敲除Ishikawa 細胞株外源表達RBM5，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系為：PSPAX 2.5 μg；PMD2G 2.5 μg；Tet-on 質(zhì)粒2.5 μg 和Neofect轉(zhuǎn)染試劑10 μL。室溫靜置15 min后滴加入培養(yǎng)皿，并用完全培養(yǎng)基補至10 mL 加入培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染方法按說明書進行。

1.2.5 CCK-8 法檢測細胞增殖 3 000 個細胞/孔種植 于96 孔板內(nèi)，CCK-8 100 μL 加入細胞中，37 ℃，5% CO2孵育2 h，于450 nm 波長處檢測吸光度（OD）值。

1.2.6 克隆形成 200個細胞/孔種于6孔板中，1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定30 min 后換成1 mL 結晶紫，室溫下靜置10 min。自來水清洗后拍照。

1.2.7 Transwell 遷移實驗 以6×104細胞/孔種于24 孔板，4%多聚甲醛室溫固定10 min；棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)細胞拍照。侵襲實驗中，按照1：10 稀釋基質(zhì)膠，鋪板后，18 h 后固定、染色、潤洗和拍照。

1.2.8 Western Blot 實驗 提取總蛋白，一抗（anti-ARID2抗體1∶1 000稀釋、anti-GAPDH抗體1∶10 000稀釋）4 ℃孵育過夜，辣根酶標記山羊抗兔IgG 室溫孵育1 h，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影及條帶灰度掃描，以GAPDH 為內(nèi)參分析。

1.2.9 qRT-PCR 用TRIzol 法提取細胞總RNA，按照說明書將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH 作為內(nèi)參基因（hmGAPDH-F：ATGACATCAAGAAGGTGGTG；hmGAPDH-R：CATACCAGGAAATGAGCTTG），qRT-PCR 檢測RBM5 的相對表達水平（RBM5-F：ACAGTCCAGAGAGAGAGCGT；RBM5-R：ACTTGTCTGCTCCACATCGG）。按照2-ΔΔct法對結果進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（）表示，3 組及以上用單因素方差分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檢測各子宮內(nèi)膜癌細胞系中RBM5 的表達情況 在Ishikawa 和KLE 親本株中RBM5 高表達，而Hec-1B 細胞系中RBM5 低表達（圖1）。因此選擇高表達RBM5 的Ishikawa 子宮內(nèi)膜癌親本株進行后續(xù)研究。

圖1 子宮內(nèi)膜癌細胞系中RBM5 蛋白的表達情況Fig.1 The expression of RBM5 protein in endometrial cancer cell lines

2.2 構建RBM5 敲除的Ishikawa 細胞系驗證 利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在Ishikawa 細胞系中成功構建了#1sg-RBM5 和#2sg-RBM5 兩株敲除單克隆細胞系，Western Blot和qRT-PCR證實RBM5已被敲除（圖2A-B，P＜0.05）。Sanger測序結果均缺失了4個堿基（TATG）引起移碼突變（圖2C-D）。

圖2 RBM5 敲除Ishikawa 細胞株的鑒定Fig.2 Identification of RBM5 knockout Ishikawa cell line

2.3 在RBM5 敲除Ishikawa 細胞株中誘導外源RBM5 表達 在RBM5 敲除Ishikawa 細胞系中構建外源RBM5 可被DOX 誘導回復表達的細胞系，結果表明回復株中外源誘導的RBM5 表達（圖3）。

圖3 RBM5 敲除Ishikawa 細胞株中RBM5 表達Fig.3 The expression of RBM5 in RBM5 knockout Ishikawa cell line

2.4 RBM5缺失對Ishikawa細胞表型的影響 RBM5敲除的Ishikawa 細胞株和親本株相比，其增殖能力顯著增強（P＜0.05），而外源誘導RMB5 表達后，增殖能力沒有變化（圖4A-B）。RBM5敲除的Ishikawa細胞株的遷移和侵襲能力與親本株相比顯著增強（P＜0.05），而外源誘導RMB5 表達侵襲和遷移能力沒有變化（圖4C-D）。

圖4 RBM5 對Ishikawa 細胞表型的影響Fig.4 Effects of RBM5 on the phenotype of Ishikawa cells

3 討論

既往報道［10-15］RBM5 在多種腫瘤中低表達，而外源性誘導RBM5 表達增加可抑制腫瘤生長。子宮內(nèi)膜癌在我國發(fā)病率高，治療難度大，因此找到新的靶點成為研究的關注目標。但RBM5 在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未闡明。本研究通過CRISPR/Cas9 技術敲除RBM5 基因，成功構建RBM5 敲除子宮內(nèi)膜癌細胞株。本研究證實選擇CRISPR/Cas9基因敲除技術能夠保證成功敲除RBM5 基因，進而獲得RBM5 子宮內(nèi)膜癌細胞敲除株，為之后的研究提供技術保障。

RBM5 作為腫瘤抑制因子可以誘導凋亡和細胞周期停滯，剪接調(diào)節(jié)casp-2，進而抑制腫瘤進展［16］。RBM5 還可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制影響p53 的活性，過表達RBM5 可以促進調(diào)節(jié)p53，進而抑制腫瘤細胞生長和克隆形成［17］。RBM5 過表達可以增強腫瘤細胞對順鉑化療敏感性，通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，激活細胞溶質(zhì)釋放細胞色素C 和caspase9/3，誘導腫瘤細胞凋亡［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)RBM5 子宮內(nèi)膜癌細胞敲除株中，腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強，提示RBM5 在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌作用，這與既往報道的RMB5 在其他腫瘤的研究結果一致。本研究首次利用CRISPR/Cas9 技術構建了RBM5 敲除株，并初步探索了RBM5 在調(diào)控子宮內(nèi)膜癌進展中的相關機制。

此外，由于CRISPR/Cas9 基因編輯技術存在脫靶的可能［20-22］，因此本研究又構建了RBM5 回復株，通過慢病毒感染細胞技術誘導RBM5 敲除株中外源RBM5 的表達，以排除RBM5 敲除株中可能存在的脫靶效應，進而排除脫靶效應對子宮內(nèi)膜癌細胞作用的影響。

本研究存在一定的局限性，首先并未完全闡明RBM5 在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌作用的具體機制，這有待于進一步探索RBM5 可能參與調(diào)控的相關信號通路。此外，本研究未對臨床樣本中RBM5 的表達及和腫瘤臨床病理特征的相關性進行分析，因此進一步研究中需分析子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織中RBM5 的表達或突變類型，以及RBM5 表達和子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)間的關系，進而為確定RBM5 在子宮內(nèi)膜癌診斷、預后或靶向治療中的應用價值提供更有力的參考。

綜上所述，本研究通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構建了RBM5 子宮內(nèi)膜癌細胞敲除細胞株，并證實RBM5 的表達缺失可以促進子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，為后續(xù)進一步研究RBM5 在子宮內(nèi)膜癌中是否存在突變及其調(diào)控機制提供了理論依據(jù)。