許 瑾，張 蘭，鐘璧歡，黃 婕，楊映雪，喬自林,2,3，楊 琨,2*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；

2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），是一種高度特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及腫瘤血管的生成[1]?？茖W(xué)研究表明，腫瘤血管比正常血管對(duì)VEGF敏感[2]。VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過(guò)自分泌及旁分泌調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，血管內(nèi)皮通透性增加，使血漿蛋白滲出，為腫瘤生長(zhǎng)提供合適的微環(huán)境。也有相關(guān)研究顯示[3-4]，VEGF在低氧或缺氧條件下，有利于其與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）表面受體結(jié)合，促進(jìn)VEGF-A的分泌，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管形成、侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤的惡性程度以及不同分化程度也會(huì)影響VEGF的作用水平[5]。

MDCK細(xì)胞是Madin和Darby于1958年從美國(guó)Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離出的呈貼壁生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞。MDCK細(xì)胞增殖迅速、易培養(yǎng)，對(duì)流感病毒敏感且不易發(fā)生突變[6]。Hela細(xì)胞系是一種常用于腫瘤研究的細(xì)胞系，采用人工體外培養(yǎng)方式可以無(wú)限繁殖。試驗(yàn)選取裸鼠為研究對(duì)象，裸鼠先天性胸腺依賴性免疫功能缺乏或T、B淋巴細(xì)胞功能完全喪失，異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，并且皮下注射腫瘤細(xì)胞系的基因?qū)?dǎo)致裸鼠成瘤[7]。本次試驗(yàn)通過(guò)HE染色法觀察腫瘤形態(tài)學(xué)特征；免疫組織SP法化學(xué)染色檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在腫瘤中的分布情況，為探究腫瘤形成機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

免疫功能缺陷小鼠：每組1 0只，雌性BALB/c裸小鼠4～7周大，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)材料：Hela細(xì)胞懸液，購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)；MDCK細(xì)胞，購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)；VEGF多克隆抗體和免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（SP-0023），均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB濃縮型顯色試劑盒（DA1010），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

試驗(yàn)儀器：病理組織切片機(jī)和YD-AB2生物組織攤-烤片機(jī)，均購(gòu)自金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司；顯微鏡拍照系統(tǒng)等。

1.3 方法

1.3.1樣本采集 前期通過(guò)注射等量的不同細(xì)胞懸液構(gòu)建裸鼠模型。

高成瘤MDCK細(xì)胞裸鼠模型：裸鼠肩胛部位皮下注射200 μl前期項(xiàng)目組經(jīng)單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)，克隆出具有高度成瘤性的MDCK細(xì)胞懸液。

Hela細(xì)胞裸鼠模型：裸鼠肩胛部位皮下注射200 μl Hela細(xì)胞懸液。

飼養(yǎng)4個(gè)月后，頸椎脫臼法處死后采集其腫瘤等新鮮組織立即置于4%多聚甲醛中固定，長(zhǎng)期室溫保存，每隔12小時(shí)更換1次固定液。

1.3.2組織包埋 采集組織于4%多聚甲醛中固定1～2個(gè)月后，將腫瘤切至體積約1 cm3進(jìn)行石蠟包埋。包埋好的組織蠟塊低溫儲(chǔ)存。病理組織切片機(jī)切片，先進(jìn)行厚度為20 μm的粗切，待觀察組織完全暴露轉(zhuǎn)為厚度為5 μm的細(xì)切。取細(xì)切的組織于組織攤-烤片機(jī)中，攤片（溫度45 ℃），后烤片（溫度45 ℃），待組織周圍石蠟與載玻片緊密粘附無(wú)水滴（約2 h）即可收片于切片盒中儲(chǔ)存。

1.3.3 HE染色 首先選取組織切片進(jìn)行烤片45 ℃（15 min），其次依次進(jìn)行脫蠟至水—蘇木精核染（約2 min）—流水沖洗（10 min）—酸水分化（約2～3 s）—流水沖洗（10 min）—伊紅染色（約4 min）—酒精分化—脫水—透明等一系列步驟，最后使用中性樹(shù)脂封片，并觀察。

1.3.4免疫組織SP法化學(xué)染色 組織切片經(jīng)15 min4 5 ℃烤片，再依次進(jìn)行脫蠟至水、抗原修復(fù)（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復(fù)法）、阻斷、滴加A液（封閉用正常山羊血清工作液）、滴加一抗、二抗、濕盒37 ℃孵育、滴加三抗（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液）、孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染等一系列操作，最后用中性樹(shù)脂封片。其中，阻斷液、A液、二抗、三抗工作液均來(lái)自免疫組化SP試劑盒；一抗為兔的多克隆抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫瘤的形態(tài)學(xué)觀察

Hela細(xì)胞、高成瘤MDCK細(xì)胞裸鼠模型中，兩種異源移植瘤的結(jié)構(gòu)相同。選取Hela裸鼠模型中的腫瘤組織進(jìn)行分析。HE染色后對(duì)腫瘤組織學(xué)結(jié)構(gòu)觀察，染色結(jié)果如圖1所示。圖1A觀察到：裸鼠皮下注射部位形成的腫瘤呈現(xiàn)結(jié)節(jié)狀，腫瘤邊緣處細(xì)胞分布密集，成巢狀，細(xì)胞體積較大，胞核大小不一。異源移植瘤中心位置可見(jiàn)壞死情況，大多為崩解碎裂的腫瘤細(xì)胞。圖1B觀察到，異源移植細(xì)胞形成的腫瘤周圍組織中有較為豐富的血管分布。

圖1 腫瘤HE染色結(jié)果觀察

2.2 VEGF在腫瘤中的表達(dá)及分布情況

如圖2所示，在異源移植細(xì)胞形成的腫瘤中，VEGF在腫瘤生長(zhǎng)的周圍組織中陽(yáng)性表達(dá)顯著，腫瘤邊緣細(xì)胞次之，腫瘤中心位置的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)最弱。VEGF在腫瘤生長(zhǎng)周圍組織以及細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞核中不表達(dá)。注射高成瘤MDCK細(xì)胞形成的腫瘤中有淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞灶（如圖2D）；通過(guò)圖2C、圖2D對(duì)比可知，VEGF在腫瘤生長(zhǎng)的周圍組織中含量：圖2C＞圖2D，腫瘤中心部位VEGF在圖2C上呈現(xiàn)強(qiáng)而少的分布，圖2D上表達(dá)呈現(xiàn)弱而廣的分布。VEGF分別在Hela細(xì)胞、高成瘤MDCK細(xì)胞裸鼠模型腫瘤中都存在表達(dá)，表達(dá)位置相同，但每個(gè)結(jié)構(gòu)表達(dá)的含量存在差異。

圖2 VEGF蛋白免疫組化染色結(jié)果

3 討論

VEGF具有促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管細(xì)胞壁通透性的功能[8]，腫瘤微環(huán)境中VEGF含量的增加有利于腫瘤血管的形成。腫瘤形成后，由于腫瘤細(xì)胞周圍沒(méi)有新血管，氧氣以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足，此時(shí)腫瘤細(xì)胞需要通過(guò)擴(kuò)散的方式獲取營(yíng)養(yǎng)，因而生長(zhǎng)緩慢。當(dāng)周圍新血管生成后，腫瘤生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由血管供給，腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)繁殖[2]。腫瘤周圍組織以及腫瘤邊緣細(xì)胞處VEGF含量的增多，促進(jìn)腫瘤血管生成，這也就說(shuō)明了本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)VEGF在腫瘤周圍近皮膚側(cè)的組織以及腫瘤邊緣均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的原因。同時(shí)，在近皮膚側(cè)的組織有血管分布，可能是腫瘤形成并已經(jīng)進(jìn)入迅速生長(zhǎng)狀態(tài)的重要標(biāo)志，阻斷腫瘤血管的生成可能是抑制腫瘤生長(zhǎng)的途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤細(xì)胞也可以分泌VEGF，加快血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)一步形成[9-10]。腫瘤的形成速率以及分化程度都會(huì)影響微環(huán)境中VEGF的水平[5]，試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，高成瘤MDCK細(xì)胞裸鼠模型的腫瘤組織中有淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞灶形成，腫瘤內(nèi)部VEGF的分布廣而弱；Hela細(xì)胞裸鼠模型中腫瘤內(nèi)部的VEGF呈現(xiàn)強(qiáng)而少的分布狀態(tài)。VEGF在皮下注射Hela細(xì)胞形成的腫瘤近皮膚側(cè)的組織含量較高，且血管分布較多，說(shuō)明皮下注射Hela細(xì)胞形成的腫瘤可能主要通過(guò)促進(jìn)微環(huán)境中的VEGF以及內(nèi)部腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF含量增多來(lái)共同促進(jìn)血管的生成，有利于腫瘤的生長(zhǎng)。而注射高成瘤MDCK細(xì)胞形成的腫瘤則是通過(guò)腫瘤內(nèi)部細(xì)胞分泌的VEGF含量增多以促進(jìn)血管形成，同時(shí)更易形成腫瘤細(xì)胞灶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移。由此推測(cè)出，注射高成瘤MDCK細(xì)胞與注射Hela細(xì)胞可能具有同等強(qiáng)度的成瘤性，形成腫瘤的惡性程度可能相同，但腫瘤的形成機(jī)制可能不同。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究VEGF在MDCK、Hela細(xì)胞裸鼠模型腫瘤中的分布情況，以及對(duì)腫瘤結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)裸鼠皮下注射部位形成的腫瘤呈現(xiàn)結(jié)節(jié)狀，高成瘤MDCK細(xì)胞裸鼠模型的腫瘤組織中有淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞灶形成，VEGF在腫瘤靠近皮膚側(cè)的組織陽(yáng)性表達(dá)顯著，腫瘤邊緣細(xì)胞次之，腫瘤中心位置的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)最弱。由此推測(cè)，高成瘤MDCK細(xì)胞與Hela細(xì)胞可能有相同的致瘤性，但兩者成瘤機(jī)制可能不同。同時(shí)結(jié)合VEGF具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等生理學(xué)功能，說(shuō)明該蛋白可能通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境促進(jìn)腫瘤血管生成，對(duì)腫瘤的形成具有一定促進(jìn)作用，也為研究通過(guò)抑制腫瘤新血管的生成阻止腫瘤發(fā)生提供理論參考。