柳立平 解從君 王海舫 李保欣 張歲 段衛(wèi)

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院肝病中心，河北 石家莊 050031)

酒精性肝病(ALD)是因為長時間機體攝入很多酒精導致的肝臟器官受到實質(zhì)性損傷導致的，通常表現(xiàn)為脂肪肝，之后逐漸發(fā)展成為酒精性肝炎、肝硬化或器官衰竭〔1〕。隨著社會生活水平的提高和飲食結構的改變，我國肝臟疾病譜發(fā)生了巨大變化〔2〕，非病毒性肝病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其中ALD發(fā)病率已達到非病毒性肝病的20%，同時由于缺乏有效的防治措施，40%的ALD患者最終會發(fā)展成為肝硬化〔3,4〕，酒精性肝硬化也逐漸成為了現(xiàn)階段肝硬化的主導因素之一，這就對ALD的預防和治療提出了新的要求。

新型小分子脂聯(lián)素受體激動劑(AdipoRon)在2013年被Miki等〔5〕第一次報道，之后先后被證實可通過結合脂聯(lián)素受體(AdipoR)1/AdipoR2激活AMP活化蛋白激酶信號通路(AMPK)或過氧化物酶體激活信號通路(PPAR)信號通路，改善糖脂代謝、減少氧化應激及炎癥反應，發(fā)揮對2型糖尿病或高脂飲食誘導的多器官損傷的保護作用〔6,7〕，研究進一步發(fā)現(xiàn)AdipoRon能夠抑制心血管疾病及癌癥的發(fā)生發(fā)展〔8〕，而AdipoRon對ALD潛在的作用機制尚未見報道。本研究通過酒精誘導人正常肝細胞L02細胞損傷，初步探究了AdipoRon對酒精性肝細胞損傷的保護作用及機制，為治療ALD提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料 人正常肝細胞L02購自上海酶研生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶溶液等均購自聯(lián)科生物；AdipoRon(MedChemExpress)；MTT(Aladdin)；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑、反轉錄試劑盒和SYBR Green Premix Ex TaqTMⅡ均購自TAKARA公司；線粒體膜電位檢測試劑盒、細胞蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天)；抗電壓依賴性陰離子通道蛋白(VDAC)1、還原型谷胱甘肽(GSH)抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體等均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；過氧化物酶增殖激活受體(PPAR)-α、固醇調(diào)控元件結合蛋白(SREBP)-1c檢測引物委托通用生物公司設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2細胞培養(yǎng)及分組造模 復蘇的細胞放入溫度為37℃，濃度為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)增殖，達到一定比例后對其進行傳代處理，收集細胞放在96孔板中，每孔數(shù)量控制在1×107個，培養(yǎng)液定期更換，在其中加入濃度為50、100、200、400及800 mmol/L的乙醇溶液，并在其中添加含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的無血清培養(yǎng)基的細胞為空白組(0 mmol/L)，誘導48 h后采用MTT法測定乙醇致肝細胞損傷的半抑制濃度(IC50)。取該濃度下的細胞分組培養(yǎng)，分別給予模型組0 μg/ml AdipoRon、低劑量組15 μg/ml AdipoRon、中劑量組30 μg/ml AdipoRon、高劑量組60 μg/ml AdipoRon，并設置對照組(空白L02細胞不做任何處理)。

1.3MTT法測定細胞活力 誘導結束后向各孔內(nèi)加入20 μl 5 g/L MTT反應液37℃，5% CO2孵育4 h，將其培養(yǎng)基吸出并在其中添加體積為100 μl DMSO溶解產(chǎn)物，室溫環(huán)境下避光震蕩15 min，使用酶標儀測定各孔在490 nm波長下的吸光值(OD值)，檢測其活力水平。

1.4細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH-Px含量測定 收集細胞，使用PBS進行洗滌，之后對其裂解，3 000 r/min離心15 min，得到上清液，測定其SOD、GSH-Px、MDA水平，相關操作步驟按照ELISA說明書進行操作。

1.5油紅O染色檢測細胞脂質(zhì)沉積 使用1 ml 4%多聚甲醛室溫對細胞固定30 min，PBS對洗滌細胞1次，滴加油紅O將細胞完全覆蓋后，室溫孵育1 h；棄油紅O，使用PBS緩沖液及60%異丙醇對細胞進行沖洗，2次；蘇木素對細胞進行染色，時間需5 min，漂洗封片，在鏡下對細胞形態(tài)等改變進行觀察。

1.6qRT-PCR檢測SERSP-1c、PPAR-α mRNA表達 TRIzol試劑使用提取細胞總RNA，逆轉錄后qRT-PCR定量檢測SERSP-1c、PPAR-α mRNA表達。qRT-PCR反映條件為預變性95℃ 5 min，擴增95℃ 1 min，退火55℃ 2 min，延伸72℃ 1 min，循環(huán)40次，檢測溶解曲線排除引物而二聚體干擾，以GAPDH為內(nèi)參基因，采集到的熒光信號值(Ct)計算2-△△Ct表示SERSP-1c、PPAR-α mRNA相對表達量。

1.7細胞線粒體膜電位測定 對離心的細胞沉淀進行處理，按照測試劑盒說明書配制線粒體膜染色工作液(JC-1)混懸細胞，室溫放置20 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞，洗滌3次，500 μl JC-1對細胞進行重懸，使用流式細胞儀測定線粒體膜電位改變程度。

1.8Western印跡檢測細胞中GSH、VDAC1蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量后行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SPS-PAGE)，電泳結束后采用濕轉法，設置0.2 A恒流將蛋白轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，一次孵育GSH、VDAC1蛋白一抗稀釋液(稀釋比1∶1 000)和二抗，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，成像前滴加電化學發(fā)光(ECL)液曝光采集發(fā)光圖像，定量分析各組樣品GSH、VDAC1蛋白相對表達量。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行LSD-t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1乙醇致L02細胞損傷IC50濃度測定 0、50、100、200、400、800 mmol/L乙醇處理L02細胞存活率分別為0.97±0.04、0.80±0.05、0.61±0.04、0.39±0.03、0.28±0.03、0.19±0.01。低濃度乙醇(0，50 mmol/L)對L02細胞存活率未發(fā)現(xiàn)明顯抑制作用，且50 mmol/L劑量下細胞存活率較空白組有升高趨勢；隨乙醇濃度升高，細胞增殖受到顯著抑制，200 mmol/L乙醇誘導48 h達到半數(shù)抑制率，故以該濃度用于誘導細胞損傷模型。

2.2AdipoRon對L02細胞增殖活力的影響 模型組細胞增殖活力顯著低于對照組(P<0.05)。不同濃度AdipoRon干預酒精損傷L02細胞后細胞增殖活力均有不同程度的升高，中劑量和高劑量組細胞增殖活力較模型組和低劑量組顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.3AdipoRon調(diào)節(jié)L02細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH-Px表達 和模型組比較，中、高濃度組細胞MDA明顯降低，SOD、GSH-Px明顯增強(P<0.05)，低劑量組GSH-Px活性明顯增強(P<0.05)；與低濃度組比較，高濃度組細胞內(nèi)MDA明顯降低(P<0.05)，中、高濃度組SOD、GSH-Px活性明顯增強(P<0.05)。見表2。

2.4AdipoRon抑制L02細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 油紅O與三酰甘油結合指示細胞內(nèi)脂質(zhì)成分，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴經(jīng)油紅O染色呈橘紅色，如圖1結果顯示，各組細胞結構清晰，核膜完整，均未出現(xiàn)結構性壞死；模型組細胞胞質(zhì)當中可以觀察到很多橘紅色脂滴，對其進行AdipoRon處理后細胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)沉積情況明顯得到改善，中、高劑量組細胞能夠觀察到脂滴染色顆粒分布并不集中，高劑量組細胞該現(xiàn)象最輕。

圖1 不同濃度AdipoRon對細胞內(nèi)脂滴數(shù)量的影響(油紅O，×400)

2.5AdipoRon對L02細胞內(nèi)SERSP-1c、PPAR-α mRNA表達影響 與模型組比較，低、中、高劑量組細胞SERSP-1c mRNA表達明顯降低，PPAR-α mRNA表達顯著增加(P<0.05)；與低濃度組比較，中、高劑量組細胞SERSP-1c mRNA表達明顯減少，PPAR-α mRNA表達明顯提高(P<0.05)；中、高濃度組細胞SERSP-1c、PPAR-α mRNA表達沒有明顯的差異(P>0.05)。見表2。

2.6AdipoRon促進L02細胞線粒體膜電位增強 JC-1染料標記細胞，高線粒體膜電位出現(xiàn)紅色熒光，反之出現(xiàn)綠色熒光。如圖2，與模型組對比，低、中、高劑量組細胞膜電位正常細胞明顯增多(P<0.05)，中、高劑量組明顯多于低劑量組(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 不同濃度AdipoRon對L02細胞增殖、MDA含量、SOD、GSH-Px活性、SERSP-1c、PPAR-α mRNA表達及線粒體功能的影響

圖2 不同濃度AdipoRon對細胞線粒體膜電位影響

2.7AdipoRon對L02細胞內(nèi)GSH、VDAC1蛋白表達影響 與模型組比較，低、中、高劑量組細胞VDAC1、GSH蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組細胞兩蛋白表達程度增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 不同濃度AdipoRon對細胞內(nèi)GSH、VDAC1蛋白表達影響

表3 不同濃度AdipoRon對細胞內(nèi)GSH、VDAC1蛋白相對表達量影響比較

3 討 論

乙醇90%都需要經(jīng)過肝臟代謝〔9〕，長期攝入會對肝細胞、肝臟組織造成嚴重損傷。在建立酒精致肝細胞損傷模型中可知200 mmol/L乙醇體外誘導L02細胞48 h可致肝細胞達半數(shù)致死率，而低濃度(0～50 mmol/L)下酒精誘導則對細胞存活率有輕微的促進作用，提示在無外源營養(yǎng)物質(zhì)的供應下，細胞能夠攝取低濃度乙醇作為能量供給，為細胞代謝提供能量。但隨著乙醇濃度的升高，細胞致死率逐漸升高并出現(xiàn)一系列氧化應激損傷、脂質(zhì)沉積及線粒體呼吸異常等異常變化。

AdipoRon能夠促進體外L02細胞損傷修復，提高細胞存活率及增殖活性。以往研究表明，乙醇在體內(nèi)代謝會誘發(fā)肝細胞氧化應激反應的發(fā)生，降低細胞抗氧化和清除自由基的能力〔10〕，本研究結果表明200 mmol/L乙醇致L02細胞損傷后模型組細胞當中MDA水平明顯增加，SOD及GSH-Px活性隨之減弱，說明細胞受自由基損傷程度較高，低劑量AdipoRon對清除細胞內(nèi)MDA含量具有一定的作用，但其效果并不明顯，AdipoRon能夠通過清除乙醇代謝產(chǎn)生的MDA，拮抗乙醇致L02細胞氧化損傷發(fā)揮肝細胞保護作用。此外，AdipoRon能有效促進細胞內(nèi)源性GSH表達，GSH作為內(nèi)源自由基清除劑〔11〕，一方面能夠協(xié)同促進L02細胞抗氧化應激，另一方面GSH能夠防止巰基氧化發(fā)揮改善線粒體通透性、維持線粒體呼吸過程中跨膜轉運及能量代謝的作用。本研究結果表明，乙醇所導致的細胞模型組線粒體膜電位和對照組明顯減少，給予不同濃度AdipoRon干預后，高線粒體膜電位細胞數(shù)量隨AdipoRon給藥濃度的增加而升高，同時，VDAC1蛋白表達水平也相應升高，VDAC1作為線粒體代謝、膜轉運關鍵蛋白〔12〕，VDAC1表達的升高和線粒體膜電位恢復進一步提示AdipoRon能夠通過改善線粒體呼吸功能及能量代謝發(fā)揮對酒精性肝細胞損傷的治療作用。

另一方面，肝脂肪變性是多數(shù)肝細胞疾病的始動環(huán)節(jié)，且早期ALD也常表現(xiàn)為脂肪肝，當乙醇誘導細胞損傷發(fā)生時，肝細胞抗氧化能力削弱，細胞內(nèi)游離脂肪酸(FFA)代謝障礙轉化為三酰甘油，進而在胞質(zhì)中以脂滴的形式儲存和蓄積〔13〕。AdipoRon能顯著抑制細胞內(nèi)乙醇誘導的脂質(zhì)沉積，削減了細胞質(zhì)中脂滴的數(shù)量，進一步探究AdipoRon對脂質(zhì)代謝的作用機制發(fā)現(xiàn)，AdipoRon能顯著抑制脂質(zhì)合成酶SREBP-1c mRNA的表達，同時促進脂質(zhì)代謝酶PPAR-α的表達，前期研究表明SREBP-1c除直接參與膽固醇、脂肪酸的合成及高密度脂蛋白的攝取外，同時參與調(diào)控多種脂質(zhì)合成靶基因的表達，上調(diào)SREBP-1c mRNA轉錄與改善肝細胞三酰甘油及膽固醇堆積機制相關〔14〕，和本研究的結果一致。在與脂聯(lián)素具有關聯(lián)性的AMPK/PPAR-α信號通路轉導過程中，脂聯(lián)素這一通路后的脂肪酸氧化加大，這一點與PPAR-α表達兩者之間存在這不可分割的聯(lián)系，而AdipoRon在許多研究中已經(jīng)證實有著和脂聯(lián)素一樣的作用機制，能夠增加AMPK表達水平〔15〕，由此推測AdipoRon可進一步通過激活PPAR-α表達、抑制脂質(zhì)合成發(fā)揮對酒精損傷細胞模型的治療作用。

綜上，AdipoRon對乙醇致L02肝細胞損傷具有治療效應，其作用機制可能與拮抗氧化應激損傷、增強細胞線粒體功能及促進細胞脂質(zhì)代謝有關，同時相關結果表明，中、高劑量下AdipoRon拮抗乙醇致L02細胞損傷作用效果相似且不存在顯著性差異，提示AdipoRon具有一定的天花板效應，其最佳作用劑量還有待進一步的探索。