于越瀛 田蓮姬 趙田田 金玫宏 崔仁哲 崔俊 (延邊大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，吉林 延吉 133000)

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種老年退行性眼科疾病〔1〕。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但氧化應(yīng)激反應(yīng)作用于視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)，促使線粒體發(fā)生損害，產(chǎn)生的活性氧(ROS)減少〔2,3〕。隨著年齡的逐漸增長，人體內(nèi)過氧化物酶的活性下降，視網(wǎng)膜RPE發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致AMD，可嚴(yán)重造成視力減退，影響日常生活質(zhì)量〔4〕。因此，發(fā)揮抗氧化作用保護(hù)RPE細(xì)胞是防止AMD的有效途徑。4-羥基壬烯醛(4-HNE)是一種醛類化合物，存在于細(xì)胞線粒體中，是導(dǎo)致線粒體功能障礙的重要物質(zhì)〔5〕。氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起4-HNE的積累，破壞信號(hào)通路、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信號(hào)，也參與各種細(xì)胞的毒性反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展〔6,7〕。人參皂苷Rb1(Rb1)不僅對(duì)心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)有保護(hù)作用〔8〕，而且具有促進(jìn)骨骼形成、增強(qiáng)免疫力、抗皮膚衰老、消除氧自由基等多種作用〔9〕。目前人參皂苷Rb1是否對(duì)RPE細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用及相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。本研究采用4-HNE損傷RPE細(xì)胞建立體外氧化損傷模型，分析人參皂苷Rb1對(duì)RPE細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19(美國ATCC公司)；人參皂苷Rb1(成都普瑞法公司)；4-HNE、二氯二氫熒光素(DCFH-DA,美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司)；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(日本Dojindo公司)；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bax、β-actin抗體(美國CST公司)；CO2培養(yǎng)箱 (美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1% 100 mg/L的青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃。當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%，定期更換培養(yǎng)基并將細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 采用傳代繁殖后ARPE-19細(xì)胞以每孔中含有5×103個(gè)細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，且每孔中分別為200 μl細(xì)胞懸液，接種于加有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，且培養(yǎng)皿1 w更換2次。細(xì)胞貼壁傳代繁殖后更換為無血清培養(yǎng)液，將不同濃度人參皂苷Rb1溶液加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，其中人參皂苷Rb1濃度分別0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L，24 h后分別在每孔中加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，顯微鏡下觀察并收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞的存活率，選擇450 nm波長，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4細(xì)胞分組及給藥處理 選擇10 μmol/L的4-HNE作為給藥適宜濃度〔10〕，再根據(jù)CCK-8法篩選藥物最佳濃度，選擇濃度為100 μmol/L的人參皂苷Rb1作為最適宜濃度，接著將ARPE-19細(xì)胞分為對(duì)照組、Rb1處理組、4-HNE組和4-HNE+Rb1處理組。對(duì)照組：進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；Rb1處理組：加入100 μmol/L Rb1作用24 h；4-HNE組：加入10 μmol/L 4-HNE細(xì)胞作用12 h；4-HNE+Rb1處理組：100 μmol/L Rb1作用24 h，隨后再加入10 μmol/L 4-HNE作用12 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組ARPE-19細(xì)胞排列、大小、形態(tài)等變化。

1.5熒光顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量 將分組處理后的細(xì)胞接種于直徑為14 mm的24孔熒光酶標(biāo)板中進(jìn)行爬片，細(xì)胞進(jìn)行良好的黏附后放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗1 min，進(jìn)行3次。采用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光染料DCFH-DA，稀釋濃度為10 μmol/L。放置于溫度為4℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光孵育10 min，孵育完成后用PBS再次洗滌3次，在熒光顯微鏡下采用熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，加入50 μl蛋白裂解液(含PMSF)，冰上裂解30 min，在4℃離心機(jī)離心15 min，提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，取50 μg蛋白樣品在10%～15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入Bax、Bcl-2、β-actin抗體4℃孵育過夜。次日，TBST洗3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST沖洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯影劑，用Image J凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算Bax和Bcl-2的相對(duì)蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1人參皂苷Rb1對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的影響 0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L Rb1作用于ARPE-19細(xì)胞24 h細(xì)胞增殖率分別為(100.00±0.37)%、(101.30±0.64)%、(101.36±0.28)%、(102.59±0.85)%、(103.21±0.57)%，各組細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50.0、100.0 μmol/L人參皂苷Rb1處理后ARPE-19細(xì)胞活性顯著提高(P<0.05)。

2.2人參皂苷Rb1對(duì)4-HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力的影響 對(duì)照組、4-HNE組、4-HNE+50 μmol/L Rb1處理組、4-HNE+100 μmol/L Rb1處理組細(xì)胞活性分別為(100.00±0.72)%、(66.39±1.14)%、(84.02±0.96)%、(89.41±1.11)%，4組間細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。組間兩兩比較，4-HNE組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；50、100 μmol/L Rb1處理組明顯高于4-HNE組(P<0.05)，且100 μmol/L Rb1處理組變化更明顯(P<0.05)。本研究選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)中人參皂苷Rb1的作用濃度為100 μmol/L。

2.3人參皂苷Rb1對(duì)4-HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 對(duì)照組細(xì)胞呈梭形、常規(guī)貼壁生長；4-HNE組細(xì)胞皺縮、數(shù)量較少、形態(tài)欠佳且細(xì)胞排列異常，部分細(xì)胞不能貼壁生長；4-HNE+Rb1處理組細(xì)胞逐漸得到緩解，形態(tài)得到改善。Rb1處理組與對(duì)照組細(xì)胞類似，無明顯差異，見圖1。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)4-HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×40)

2.4熒光顯微鏡下觀察Rb1對(duì)各組細(xì)胞ROS生成的影響 對(duì)照組和Rb1處理組幾乎沒有呈現(xiàn)綠色高熒光，而4-HNE組相較于對(duì)照組呈現(xiàn)綠色高熒光信號(hào)增強(qiáng)；4-HNE+Rb1處理組相比較于4-HNE組呈現(xiàn)出綠色高熒光信號(hào)減弱，見圖2。

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)4HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響(×40)

2.5人參皂苷Rb1對(duì)4-HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組、4-HNE組、4-HNE+Rb1處理組Bcl-2/Bax表達(dá)(1.85±0.16、0.36±0.05、1.03±0.06)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與對(duì)照組相比，4-HNE組Bcl-2/Bax表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與4-HNE組相比較，4-HNE+Rb1處理組明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖3。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)4-HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

隨著日常人口老齡化速度的加快及人均壽命的逐漸延長，AMD成為老年人視力下降的原因之一，目前臨床上對(duì)于AMD大多采用抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)治療〔11〕。有研究表明，氧化應(yīng)激是AMD發(fā)病原因之一〔12〕，且隨著人類的年齡逐漸增長，身體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)越來越多，造成各器官逐漸衰老，進(jìn)而加重?fù)p傷視網(wǎng)膜〔13〕，使視網(wǎng)膜光感受器受損，RPE層細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)作為AMD的致病因素已得到證實(shí)〔14〕。臨床上使用抗氧化劑對(duì)AMD患者的視力有改善作用〔15〕。抗氧化劑越來越受到重視，成為治療AMD研究探討的熱點(diǎn)。

Rb1作為人參皂苷中含量最多的一種有效成分〔16〕，能改善衰老小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平〔17〕。人參皂苷Rb1也可抑制視神經(jīng)RGC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激〔18〕。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞中的ROS增多，造成視網(wǎng)膜功能損害〔19〕。本研究證明4-HNE可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化損傷；人參皂苷Rb1可以清除4-HNE誘導(dǎo)生成的ROS，促進(jìn)RPE細(xì)胞抗氧化損傷，提示人參皂苷Rb1對(duì)視網(wǎng)膜氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

研究顯示RPE細(xì)胞功能受損可引起細(xì)胞凋亡，而人參皂苷Rb1具有顯著的抗凋亡活性〔20,21〕。本研究結(jié)果提示人參皂苷Rb1能夠抑制4-HNE誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)一步提示人參皂苷Rb1能對(duì)RPE細(xì)胞功能受損引起的細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

綜上，人參皂苷Rb1對(duì)4-HNE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，為臨床治療AMD等視網(wǎng)膜疾病的防治提供了新的診療策略。