張寶成 李榮新 鐘志越 (復旦大學附屬金山醫(yī)院急危重病中心，上海 201508)

腦卒中是包括缺血性和出血性腦卒中，其中70%為缺血性腦卒中〔1,2〕。由于腦卒中多為急性發(fā)作，一直缺乏有效的治療手段，因此腦卒中成為當今世界人類主要的死亡誘因之一〔3,4〕。腦卒中缺血發(fā)生后血液再灌注是治療的第一步，但同時這也會引起嚴重腦部損傷，即腦缺血再灌注損傷，目前也缺乏有效的治療方法〔5～7〕。探索修復腦缺血再灌注的治療方法和分子機制對于腦卒中臨床治療具有重要的科學和臨床價值。甲烷是天然氣主要成分，也是公認的對人體有害物質，但是低濃度的吸入性甲烷卻可以修復腦缺血再灌注引起的損傷。本文探討吸入性甲烷對腦缺血再灌注損傷大鼠紅細胞衍生核因子2樣蛋白(NFE2L2)和血紅素氧合酶(HO)-1表達及氧化應激影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康SD大鼠雄性36只，清潔性飼養(yǎng)，體重(220±20)g，室溫(23±2)℃，濕度50%～70%，自由飲食飲水適應性飼養(yǎng)1 w，大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2主要試劑 NFE2L2一抗(博士德生物工程有限公司)，大鼠HO-1、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.3方法

1.3.1實驗分組及給藥 36只大鼠隨機分為假手術組、模型組和實驗組各12只。實驗組給予吸入性甲烷10 ml/kg，1次/d；假手術組和模型組給予等劑量生理鹽水吸入，1次/d。各組大鼠連續(xù)15 d。

1.3.2腦缺血再灌注損傷大鼠模型制備 腦缺血再灌注損傷大鼠模型采用改良Longa法制備，于末次給藥2 h后，給予350 mg/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，于大鼠頸中切口；暴露分離大鼠左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，將大鼠頸外動脈根部和頸總動脈近心端給予結扎；大鼠頸內動脈采用顯微動脈夾夾閉，在頸總動脈結扎處附近打一活結；并且在頸總動脈結扎與活結處間剪開一切口，從頸總動脈將線栓緩慢插入頸內動脈，感受到明顯阻力時停止，且系緊活結。再于大鼠腦缺血2 h后，將線栓拔出15 mm左右，形成再灌注，而其中假手術組不將線栓插入頸內動脈，其余處理方法相同。

1.4觀察指標

1.4.1神經(jīng)功能缺損評分標準 評分0～4分，評分越高神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.4.2腦梗死面積計算 處死大鼠取腦，采用紅四氮唑(1%)將大鼠正常腦組織被染成紅色，而梗死區(qū)域呈白色。腦梗死面積百分比運用Image pro plus6.0軟件計算。

1.4.3腦組織含水量測定 采用干濕重法測定腦組織含水量。

1.4.4NFE2L2蛋白測定 采用Western印跡測定大鼠腦組織NFE2L2蛋白，取大鼠腦組織，低溫下反復研磨制備腦組織勻漿；加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液適量，放置于4℃離心后取上清，總蛋白濃度采用二喹啉甲酸(BCA)法測定。以20 μg總蛋白上樣，行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；封閉、漂洗，加入NFE2L2一抗(1∶500)，在4℃過夜，加入辣根過氧化物標記的二抗(1∶2 000)；洗膜，發(fā)光顯影，曝光拍照。以Image pro plus6.0圖像處理，以NFE2L2與GADPH蛋白表達灰度值表示NFE2L2蛋白相對表達水平。

1.4.5HO-1表達測定 取大鼠腦組織，以半徑10 cm，轉速3 000 r/min，離心6 min，取上清液，置于-20℃下保存待測，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定HO-1表達。

1.4.6氧化應激測定 取大鼠腦組織，以半徑10 cm，轉速3 000 r/min，離心6 min，取上清液，置于-20℃下保存待測，采用分光光度法測定腦組織SOD、GSH-Px和MDA表達。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量比較 模型組和實驗組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量明顯高于假手術組(P<0.05)；實驗組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量比較

2.2各組NFE2L2蛋白表達比較 模型組(1.07±0.16)和實驗組腦組織NFE2L2蛋白表達(1.35±0.19)明顯低于假手術組(1.69±0.21，P<0.05)；實驗組腦組織NFE2L2蛋白表達明顯高于模型組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組NFE2L2蛋白表達

2.3各組腦組織HO-1表達比較 模型組〔(1.89±0.46) mmol/L〕和實驗組腦組織HO-1表達〔(3.78±1.04)mmol/L〕明顯低于假手術組〔(5.32±1.29)mmol/L,P<0.05〕；實驗組腦組織HO-1表達明顯高于模型組(P<0.05)。

2.4各組氧化應激變化比較 模型組和實驗組腦組織SOD和GSH-Px水平明顯低于假手術組，而MDA水平明顯高于假手術組(P<0.05)；實驗組腦組織SOD和GSH-Px水平明顯高于模型組，而MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組氧化應激變化比較

3 討 論

腦血管病作為老年人群的常見慢性病，其發(fā)病率占缺血性腦血管病80%左右〔8～12〕。目前，藥物治療腦缺血再灌注損傷效果并不十分理想，且毒副作用較大。甲烷是自然界中最常見的烷烴和天然氣的主要成分，通常作為燃料使用。然而，研究發(fā)現(xiàn)生物機體內源性的甲烷具有十分重要的生理功能，尤其在對抗缺血再灌注損傷方面作用顯著〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)甲烷通過抗炎癥、抗氧化和抗凋亡等方式保護肝、脊髓、眼睛、皮膚及腸等器官和組織免受缺血再灌注損傷〔14〕。低濃度的吸入性甲烷卻可以修復腦缺血再灌注引起的損傷。然而，低濃度吸入性甲烷保護機體免受腦缺血再灌注損傷的機制仍不明確。由本研究結果可見吸入性甲烷可減輕大鼠神經(jīng)功能缺損，降低大鼠腦梗死面積和腦組織含水量。

HO-1屬重要的一種免疫調節(jié)分子和炎癥抑制因子，在穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊及抑制動脈粥樣硬化發(fā)展中發(fā)揮作用。NFE2L2是調控HO-1表達的轉錄因子，對HO-1表達具有正調控作用。研究表明，富甲烷鹽水通過上調NFE2L2和HO-1表達來降低脊髓缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎性因子和氧化產(chǎn)物，從而保護大鼠脊髓免受損傷〔15〕。本研究表明吸入性甲烷可上調NFE2L2蛋白和HO-1表達。

腦缺血再灌注損傷的病理機制中氧化應激是重要之一，由于腦組織血氧量高、代謝旺盛，則會造成生成較多的活性氧(ROS)，但由于腦組織自身缺血抗氧化物質，而易受ROS侵害，且會在代謝反應應激狀態(tài)下和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，直接損傷核酸、脂質、蛋白質等細胞內大分子，從而造成細胞死亡。其中SOD和GSH-Px是體內重要的抗氧化物酶，不僅能夠清除細胞中ROS，同時還具有保護細胞免受氧化損傷的作用；MDA是脂質過氧化反應的一種終產(chǎn)物，其水平高低能夠反映氧化應激程度。本研究表明吸入性甲烷可調節(jié)氧化應激水平。

綜上，吸入性甲烷可減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，上調NFE2L2蛋白和HO-1表達及調節(jié)氧化應激水平。