任吉蓮 崔靈芝 郝小夏 李曉顏 常彥祥

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，山西 汾陽(yáng) 032200；2山西省腫瘤醫(yī)院干部診療科；3山西省汾陽(yáng)醫(yī)院檢驗(yàn)科；4西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是全世界癌癥死亡的主要原因之一，每年約有超過(guò)100萬(wàn)人因NSCLC死亡〔1〕。在最近的幾十年中，由于診斷、手術(shù)和聯(lián)合治療等方法的改進(jìn)，NSCLC患者的生存率有了顯著提高。由于NSCLC有極高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，5年生存率僅為15%〔2〕。因此深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，確定新的治療靶點(diǎn),對(duì)于改善NSCLC患者的治療現(xiàn)狀具有重要意義。

微小RNA(miRNA)由18～25個(gè)核苷酸組成，是一類內(nèi)源性核糖調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)RNA干擾途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔3〕。研究報(bào)道人類miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡和分化中發(fā)揮生理作用〔4〕。某些miRNA可能是癌癥診斷和預(yù)后的標(biāo)志物〔5〕。研究表明miR-488在多種腫瘤中表達(dá)異常，可作為抑癌基因〔6,7〕。研究表明miR-488通過(guò)真核起始因子(eIF)3a介導(dǎo)的NER信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和順鉑敏感性〔8〕。但miR-488對(duì)NSCLC的具體作用機(jī)制仍不清楚。本文旨在探究miR-488對(duì)NSCLC A549干樣特性和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10只Balb/c裸鼠購(gòu)自北京維通利華維通利華動(dòng)物科技有限公司，雄性，5周齡，體重(20±2)g，許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0001，在特定的無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)。

1.2試驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基(12100-046)、青-鏈霉素(15140-122)、胎牛血清(26400-036)、胰蛋白酶(15050-057)和F12培養(yǎng)基(21700-075)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑(C0535)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062M)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1091)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；anti CD44(ab157107)、干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(SOX)2(ab97959)、八聚體結(jié)合因子(OCT)4(ab18976)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3(ab13847)、Caspase-9(ab52298)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B、人腺癌細(xì)胞PC-9、人肺黏液上皮樣癌細(xì)胞H292，人非NSCLC細(xì)胞A549來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，1∶2傳代。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.4細(xì)胞處理及分組 按照1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待60%融合度時(shí)更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。采用LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑將mimic-NC和miR-488 mimic組轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：Control組、mimic-NC組和miR-488 mimic組。

1.5RT-PCR 用Trizol法從BEAS-2B細(xì)胞、PC-9細(xì)胞、H292細(xì)胞和A549細(xì)胞中提取總RNA，用Nanodrop 分光廣度計(jì)測(cè)定吸光度(A260/A280)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成和PCR的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的條件為：94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)10 min。于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)表達(dá)情況。

1.6成球?qū)嶒?yàn) 將各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)后鋪至超低黏附96孔板。每孔100 μl F12成球培養(yǎng)基，含10個(gè)活細(xì)胞，各鋪10個(gè)復(fù)孔。靜置培養(yǎng)14 d后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成球率及細(xì)胞成球直徑。細(xì)胞成球率=每孔細(xì)胞成球球數(shù)目總數(shù)/每孔細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組A549細(xì)胞，接種于5孔板中，用流式細(xì)胞儀按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡率。

1.8Western印跡 取各組待測(cè)細(xì)胞，加含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，用BCA試劑盒提取總蛋白并測(cè)定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗(CD44、SOX2、OCT4、Caspase-3、Caspase-9)，4℃過(guò)夜孵育后用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗并加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析膠片灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH為上樣量參照，重復(fù)3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.9裸鼠移植瘤模型的建立 參照鄭興等〔9〕方法，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Control組、miR-488 mimic組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后調(diào)整為細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液接種于BALB/c裸鼠右腋窩，建立實(shí)體腫瘤模型。2 w后通過(guò)頸椎脫位法處死裸鼠，取腫瘤組織稱重。

1.10免疫組化 取各組裸鼠腫瘤組織石蠟切片，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)燃，鹽酸酒精分色，在光學(xué)顯微鏡下觀察CD44的表達(dá)情況，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。重復(fù)3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.11TUNEL染色 取各組裸鼠腫瘤組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，將切片用蛋白酶K消化，按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)深棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，采用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-488在BEAS-2B、PC-9、H292、A549細(xì)胞中表達(dá)水平 與BEAS-2B細(xì)胞miR-488水平(1.02±0.03)比較，PC-9、H292、A549細(xì)胞均顯著降低(0.53±0.01，0.47±0.02，0.26±0.03，P<0.05)，且A549細(xì)胞miR-488表達(dá)最低，因此本實(shí)驗(yàn)選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-488表達(dá)水平 與Control組和mimic-NC組(1.00±0.00，1.03±0.05)相比，miR-488 mimic組miR-488 mRNA水平顯著升高(58.00±9.00，P<0.05)。

2.3轉(zhuǎn)染miR-488 mimic降低A549細(xì)胞成球直徑、成球率 與Control組和mimic-NC組相比，miR-488 mimic組細(xì)胞成球直徑、成球率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)

表1 轉(zhuǎn)染miR-488 mimic對(duì)A549細(xì)胞成球直徑、成球率的影響

2.4轉(zhuǎn)染miR-488 mimic下調(diào)A549細(xì)胞CD44、SOX2、OCT4蛋白表達(dá)水平 與Control組和mimic-NC組相比，miR-488 mimic組CD44、SOX2、OCT4蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)CD44、SOX2、OCT4蛋白表達(dá)

表2 轉(zhuǎn)染miR-488 mimic對(duì)A549細(xì)胞CD44、SOX2、OCT4蛋白表達(dá)水平的影響

2.5轉(zhuǎn)染miR-488 mimic促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 與Control組和mimic-NC組細(xì)胞凋亡率〔(5.0±2.5)%、(4.8±2.2)%〕相比，miR-488 mimic組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(27.8±3.0)%，P<0.05〕。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.6轉(zhuǎn)染miR-488 mimic上調(diào)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平 與Control組和mimic-NC組相比，miR-488 mimic組Caspase-3、Caspase-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)

表3 轉(zhuǎn)染miR-488 mimic對(duì)A549細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響

2.7轉(zhuǎn)染miR-488 mimic對(duì)肺癌裸鼠移植瘤模型的影響 與Control組相比，miR-488 mimic組腫瘤重量、CD44陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表4。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-488 mimic對(duì)肺癌裸鼠移植瘤模型CD44陽(yáng)性陽(yáng)性表達(dá)率和腫瘤細(xì)胞凋亡的影響(免疫組化，×200)

表4 轉(zhuǎn)染miR-488 mimic對(duì)肺癌裸鼠移植瘤模型的影響

3 討 論

NSCLC是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。尋找能早期診斷NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。miRNA是由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子單鏈RNA。miRNA通過(guò)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，不僅參與調(diào)控細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，還在腫瘤細(xì)胞增殖、耐藥等許多重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。miRNA的表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)，可作為腫瘤的標(biāo)志物〔10〕。

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中具有自我更新能力的細(xì)胞，其可分化成不同家族的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成整個(gè)腫瘤〔11〕。腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞表型后具有較強(qiáng)的成球能力，并分化成其他類型的腫瘤細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞表型的獲得是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特性，也是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素之一〔12〕。研究表明NSCLC的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、抗輻射及耐藥性等惡性表型特征都與NSCLC干細(xì)胞相關(guān)〔13〕。肺癌干細(xì)胞凋亡能力低于普通的肺癌細(xì)胞〔14〕。CD44、SOX2與OCT4作為NSCLC干細(xì)胞標(biāo)志物，在維持干細(xì)胞多能性方面起著重要作用，其參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等過(guò)程〔15〕。劉罡等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)miR-34a靶向調(diào)節(jié)CD44抑制NSCLC干細(xì)胞成球和侵襲能力。項(xiàng)保利等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子OCT4和SOX2在NSCLC病灶內(nèi)表達(dá)度高。本研究結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-488 mimic抑制A549細(xì)胞干樣特性。

凋亡是細(xì)胞的程序化死亡，使生物體在其正常發(fā)育的過(guò)程中殺死和去除不需要的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡紊亂是癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵〔18〕。Caspase在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行中起關(guān)鍵作用，Caspase-9是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)子，也是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者，酶切Caspase-9可進(jìn)一步激活Caspase-3，Caspase-3可通過(guò)破壞細(xì)胞的完整性和裂解核酸酶使細(xì)胞凋亡〔19〕。Wei等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)miR-488通過(guò)靶向高遷移率族核小體結(jié)構(gòu)域(HMGN)5促進(jìn)RCC細(xì)胞凋亡。Jin等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)miR-448靶向Rab2B上調(diào)Caspase-3、Caspase-9表達(dá)誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-488 mimic促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。

綜上，miR-488抑制A549細(xì)胞干樣特性，促進(jìn)凋亡，抑制NSCLC裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，提示miR-488可成為潛在的NSCLC基因治療靶點(diǎn)。