郝甜甜，許聰,2，王際英*，劉財(cái)禮,2，沈玉博,2，李寶山，孫永智，黃炳山

(1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省海水漁用飼料工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái) 264006；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年中國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)2 135.31 萬t，已躍居世界首位[1]。魚粉作為優(yōu)質(zhì)蛋白源是海水魚配合飼料中的主要蛋白源，約占飼料成本的60%，而飼料成本占總養(yǎng)殖成本的60%～80%，較高的養(yǎng)殖成本是制約海水養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸[2]。近年來，隨著魚粉資源不斷縮減且價(jià)格持續(xù)飆升，植物蛋白替代魚粉研究逐漸引起關(guān)注，但是替代蛋白源的適口性、抗?fàn)I養(yǎng)因子和氨基酸不平衡等問題卻限制了其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用，利用植物性原料完全替代海水魚飼料中的魚粉仍是一個(gè)難題。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，在鲆鰈魚飼料中，當(dāng)大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉超過40%[3]，酶解豆粕和棉籽粕替代魚粉超過58.8%[4]時(shí)，均會(huì)顯著降低幼魚的生長(zhǎng)性能和免疫能力。有研究表明，在高植物蛋白飼料中添加外源添加劑是提高植物蛋白源利用率的重要途徑之一，且能實(shí)現(xiàn)節(jié)約魚粉及充分發(fā)揮植物蛋白優(yōu)勢(shì)的目的[5-6]。因此，尋求在低魚粉條件下提高海水魚生長(zhǎng)性能和免疫能力的外源添加劑，已成為近年來海水魚營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。

酶解魚溶漿(stickwater hydrolysate，SWH)是采用酶解生產(chǎn)工藝，以魚溶漿作為原料，加入一些酶類，在50～55 ℃酶解3～5 h后得到的產(chǎn)品[7]。羅其剛等[8]研究表明，在草魚Ctenopharyngodonidellus飼料中添加魚溶漿能達(dá)到節(jié)約魚粉、增強(qiáng)魚體脂肪能量代謝和促進(jìn)魚體生長(zhǎng)的效果。周露陽等[7]研究表明，在黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco日糧中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5%的酶解魚溶漿可完全替代28%的魚粉，且酶解魚溶漿的促生長(zhǎng)效果優(yōu)于魚溶漿。植物精油(essential oil)是一類從植物中提取的含有揮發(fā)油類的物質(zhì)，含有多種活性成分，具有殺菌抑菌、抗氧化、抗炎、抗癌和免疫刺激等功能，且在畜禽產(chǎn)品中無殘留，是一種綠色、安全、環(huán)保的飼料添加劑[9]。王猛強(qiáng)等[10]在凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei飼料不同魚粉水平下添加不同水平的植物精油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在降低魚粉含量情況下，飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的精油可提高幼蝦生長(zhǎng)性能和改善其腸道健康。蔣溥等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis飼料中添加1 000 mg/kg的肉桂醛可顯著增強(qiáng)魚體的抗病能力并改善其腸道健康狀況。

大菱鲆Scophthalmusmaximus隸屬鰈形目Pleuronectiformes鲆科Scophthalmidae瘤棘鲆屬Psetta，俗稱多寶魚，是中國(guó)鲆鰈魚類養(yǎng)殖第一大品種，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]。大菱鲆飼料配方中魚粉含量較多(高于40%)[13]，而關(guān)于酶解魚溶漿和植物精油在大菱鲆低魚粉飼料中的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中，以大菱鲆幼魚為研究對(duì)象，以小麥粉、大豆?jié)饪s蛋白等替代基礎(chǔ)飼料(含50%魚粉)中20%魚粉，單獨(dú)或聯(lián)合添加酶解魚溶漿和植物精油，以考察大菱鲆幼魚生長(zhǎng)性能、消化酶活力、血清生化指標(biāo)及雷帕霉素靶蛋白(TOR)相關(guān)基因表達(dá)的變化，以期為酶解魚溶漿和植物精油在大菱鲆飼料中的合理應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚苗購自山東科合海洋高技術(shù)有限公司。養(yǎng)殖試驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院全封閉水循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行。正式開始試驗(yàn)前將試驗(yàn)魚放入藍(lán)色圓柱形塑料養(yǎng)殖桶(直徑為70 cm，高為80 cm，水深為50 cm)中暫養(yǎng)1 周。

酶解魚溶漿購自榮成海圣飼料有限公司，其中脂肪酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶三者的質(zhì)量比為2∶2∶1，50 ℃下酶解3 h，獲得酶解產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)成分見表1。包被精油由廣州中牧農(nóng)科技有限公司提供(肉桂醛含量≥15%)。

表1 酶解魚溶漿營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 Nutrient compositions of stickwater hydrolysate

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的制作 以魚粉和酪蛋白為主要蛋白源，魚油和豆油為主要脂肪源。設(shè)計(jì)魚粉含量為50%的飼料為正對(duì)照組(D0)，魚粉含量為30%的飼料為負(fù)對(duì)照組(D1,用大豆?jié)饪s蛋白等蛋白替代魚粉)，在負(fù)對(duì)照組飼料中補(bǔ)充蛋氨酸和賴氨酸，使之達(dá)到與正對(duì)照組一致水平。在負(fù)對(duì)照組基礎(chǔ)上添加含量為1%酶解魚溶漿(D3)、0.02%包被精油(D4)、1%酶解魚溶漿+0.02%精油(D5)，共配制成5組試驗(yàn)飼料(本文中飼料成分含量%均指質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

將所有飼料原料粉碎后過198 μm孔徑篩，按飼料配方混合均勻，加入魚油及適量水再次混勻，經(jīng)螺旋擠壓機(jī)加工成粒徑為3 mm的飼料顆粒，60 ℃下烘干后置于-20 ℃冰箱備用。飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分組成見表2。

表2 飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分組成(干質(zhì)量)Tab.2 Ingredient and proximate nutrient composition of the test diets (dry weight basis)

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)魚暫養(yǎng)結(jié)束后，禁食24 h，挑選體格健壯、規(guī)格均一的大菱鲆幼魚(體質(zhì)量為37.67 g)隨機(jī)分成5 組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放30尾魚，分別投喂5種試驗(yàn)飼料。養(yǎng)殖周期為8周，每天8:30、16:30投喂，投喂量為魚體質(zhì)量的1.2%～1.5%，投喂結(jié)束后統(tǒng)計(jì)殘餌量。養(yǎng)殖期間如有死魚記錄數(shù)量并稱重。整個(gè)試驗(yàn)期間，控制水溫為(16±1)℃，鹽度為27～28，溶解氧質(zhì)量濃度>6 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度<0.01 mg/L。

1.2.3 樣品采集 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，試驗(yàn)魚禁食24 h后，采用丁香酚麻醉，以桶為單位稱其質(zhì)量，并分別計(jì)算成活率、增重率和飼料系數(shù)。從每桶隨機(jī)選擇12 尾幼魚，分別測(cè)定其體質(zhì)量、體長(zhǎng)，計(jì)算肥滿度。從尾靜脈取血，血樣在4 ℃下靜置4 h，以4 000 r/min離心10 min，取血清，-80 ℃下保存待測(cè)；隨后解剖內(nèi)臟并分離腸道。另在無菌條件下，隨機(jī)取3 尾試驗(yàn)魚采血后取肝尖，將3 尾魚肝尖合并放入無RNA酶管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算

1)生長(zhǎng)指標(biāo)。計(jì)算公式為

增重率=(Wt-W0)/W0×100%，

特定生長(zhǎng)率=(lnWt-lnW0)/t×100%，

飼料系數(shù)=Wf/(Wt-W0)，

肥滿度=W/L3×100，

蛋白質(zhì)效率=(Wt-W0)/(Wf×Cp)，

成活率=Nt/N0×100%。

其中：W0為試驗(yàn)開始時(shí)魚體質(zhì)量(g)；Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體質(zhì)量(g)；Wf為攝食量(g)；Cp為飼料蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；W、L分別為魚體質(zhì)量(g)、體長(zhǎng)(cm)；Nt、N0分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)試驗(yàn)魚存活數(shù)量(ind.)；t為養(yǎng)殖時(shí)間(d)。

2)血清酶活性。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定血清中溶菌酶(lysozyme，LZM)活性；采用上海酶聯(lián)生物公司ELISA試劑盒測(cè)定補(bǔ)體C3、C4含量。

3)腸道消化酶活性。采用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測(cè)定腸道胰蛋白酶(trypsin)、淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)活性，具體操作嚴(yán)格按照各試劑盒說明書執(zhí)行。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)濃度。

4)肝臟TOR相關(guān)基因表達(dá)量。將-80 ℃下凍存的大菱鲆肝臟組織按照Trizol試劑盒(TaKaRa)說明書提取總RNA。參照唐卓懿等[14]設(shè)計(jì)的TOR、4EBP1、4EBP2基因引物(表3)，同時(shí)以RPSD(DQ848899.1)為內(nèi)參基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。采用熒光定量PCR方法檢測(cè)，按照SYBR Premix ScriptTMRT PCR 試劑盒說明書將提取的總RNA先反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR GreenⅠ嵌合熒光進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下循環(huán)變性5 s；56 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)?；赥OR、4EBP1、4EBP2及RPSD基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的表達(dá)量，以正對(duì)照組為基值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表3 試驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Tab.3 Real-time PCR primers in the experiment

1.2.5 攻毒試驗(yàn) 參照郝甜甜等[15]的方法進(jìn)行鰻弧菌Vibrioanguillarum培養(yǎng)及魚體感染試驗(yàn)。生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，從每桶隨機(jī)取10 尾健康大菱鲆腹腔注射鰻弧菌液，注射劑量為7.94×105CFU/g組織，對(duì)照組注射等量生理鹽水。注射48 h后統(tǒng)計(jì)魚死亡數(shù)量，累積死亡率計(jì)算公式為

累積死亡率=病死魚數(shù)量/初感染魚數(shù)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著，則采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大菱鲆幼魚生長(zhǎng)性能的變化

從表4可見：養(yǎng)殖8 周后，各組間大菱鲆幼魚的成活率和肥滿度無顯著性差異(P>0.05)；低魚粉飼料中添加酶解魚溶漿組(D3)，以及酶解魚溶漿和植物精油聯(lián)合組(D5)幼魚的增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于正、負(fù)對(duì)照組(D1、D2)(P<0.05)，且D3組顯著高于D5組(P<0.05)，添加植物精油組(D4)幼魚增重率和特定生長(zhǎng)率與正、負(fù)對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；D3組蛋白質(zhì)效率最高，且顯著高于其他組(P<0.05)；D3組飼料系數(shù)最低，且顯著低于負(fù)對(duì)照組(P<0.05)，與正對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

表4 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)性能的影響Tab.4 Effects of stickwater hydrolysate and plant essential oils on growth performance of juvenile turbot Scophthalmus maximus

2.2 各組大菱鲆幼魚血清免疫指標(biāo)的變化

從表5可見：幼魚血清溶菌酶活力在負(fù)對(duì)照組最低，在D5組最高，其中D3、D4和D5組顯著高于負(fù)對(duì)照組(P<0.05)；C3酶活力在D5組最低,且顯著低于其他組(P<0.05)；各組間幼魚血清C4酶活力無顯著性差異(P>0.05)。

表5 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚血清免疫指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of stickwater hydrolysate and plant essential oils on immunity of juvenile fish

2.3 各組大菱鲆幼魚的抗鰻弧菌感染能力

試驗(yàn)魚養(yǎng)殖8周后，進(jìn)行鰻弧菌注射感染試驗(yàn)，感染48 h后，統(tǒng)計(jì)各組魚的累積死亡率。從圖1可見，D1～D5組魚的累積死亡率分別為63.33%、80.00%、73.33%、53.33%、53.33%，其中，D4和D5組的累積死亡率顯著低于負(fù)對(duì)照組(P<0.05)，但與正對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 各組大菱鲆幼魚腸道消化酶活力的變化

從表6可見：D3組幼魚腸道胰蛋白酶較負(fù)對(duì)照組、D4和D5組顯著升高(P<0.05)，但與正對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；各組間幼魚腸道脂肪酶和淀粉酶活力均無顯著性差異(P>0.05)。

表6 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚腸道消化酶活力的影響Tab.6 Effects of stickwater hydrolysate and plant essential oils on digestive enzyme activity of juvenile fish

2.5 各組幼魚肝臟TOR相關(guān)基因表達(dá)的變化

從圖2可見：在低魚粉飼料中添加酶解魚溶漿和植物精油對(duì)大菱鲆幼魚肝臟TOR、4EBP1和4EBP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均有顯著性影響(P<0.05)；TORmRNA相對(duì)表達(dá)量在D3組達(dá)到最高值，且顯著高于其他各組(P<0.05)；4EBP1和4EBP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均在D3組達(dá)到最低值，且顯著低于其他各組(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示同一指標(biāo)下不同組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Means with different letters in the same index are significantly different in the different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖1 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)弧菌感染后幼魚累積死亡率的影響Fig.1 Effects of stickwater hydrolysate and plant essential oils on cumulative mortality of juvenile fish challenged with Vibrio anguillarum

圖2 肝臟中TOR、4EBP1和4EBP2 mRNA的表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of TOR,4EBP1 and 4EBP2 mRNA in liver

3 討論

3.1 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚生長(zhǎng)性能的影響

酶解魚溶漿應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中，主要優(yōu)勢(shì)是能保持水解物的新鮮度和魚體中特殊的有效成分[16]。本試驗(yàn)中，負(fù)對(duì)照組增重率與正對(duì)照組相比無顯著性差異，這表明植物蛋白部分替代魚粉對(duì)魚體的生長(zhǎng)性能無負(fù)面影響。而在低魚粉飼料中單一添加酶解魚溶漿則顯著提高了大菱鲆幼魚增重率，較正對(duì)照組提高了23.40%，較負(fù)對(duì)照組提高了20.93%，飼料系數(shù)較正、負(fù)對(duì)照組分別降低了5.68%、12.50%，主要原因是相比于魚粉和植物蛋白，酶解魚溶漿含有更多的可消化蛋白、小肽、氨基酸等活性成分，這類物質(zhì)在低魚粉飼料中對(duì)維持魚體生理健康及促生長(zhǎng)方面具有較大作用[17]。這與對(duì)大黃魚Pseudosciaenacrocea[18]、大西洋鮭Salmosalar[19]等肉食性魚類的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，低魚粉飼料中單一添加植物精油組幼魚增重率和特定生長(zhǎng)率與正、負(fù)對(duì)照組無顯著性差異，這與對(duì)羅非魚Oreochromisniloticus[20]、銀鲇Lippiaalba[21]的研究結(jié)果不一致。原因可能是：第一，飼料蛋白源的不同導(dǎo)致精油在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用效果不同[22]；第二，試驗(yàn)對(duì)象的不同，淡水魚與海水魚在食性及消化生理方面差異較大，導(dǎo)致精油在不同魚體中的應(yīng)用效果有一定差異[23]。此外，本試驗(yàn)中，在低魚粉飼料中單一添加酶解魚溶漿組幼魚的增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于單一添加精油組和二者聯(lián)合添加組，且聯(lián)合添加組生長(zhǎng)性能顯著高于單一添加精油組，這說明酶解魚溶漿和精油聯(lián)合添加具有一定協(xié)調(diào)增效，但具體配伍、二者間的互作關(guān)系及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.2 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚免疫能力的影響

本試驗(yàn)中，負(fù)對(duì)照組顯著降低了幼魚血清溶菌酶和C3含量，表明用植物蛋白替代部分魚粉雖然對(duì)幼魚生長(zhǎng)無顯著性影響，但已影響了幼魚的免疫能力，這與對(duì)凡納濱對(duì)蝦[24]的研究結(jié)果一致。Liang等[25]報(bào)道，在海鱸Lateolabraxjaponicus飼料中添加水解魚蛋白能顯著提高幼魚補(bǔ)體活性和溶菌酶活性；唐宏剛[26]研究發(fā)現(xiàn)，在大黃魚飼料中添加水解蛋白后顯著提高了幼魚溶菌酶活性及C3、C4水平，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說明在低魚粉飼料中添加酶解魚溶漿可顯著提高大菱鲆幼魚非特異性免疫能力，其作用機(jī)理可能與酶解產(chǎn)物中的生物活性肽有關(guān)[27]。本試驗(yàn)中，與負(fù)對(duì)照組相比，在低魚粉飼料中添加植物精油顯著提高了幼魚溶菌酶活性，表明在大菱鲆飼料中補(bǔ)充植物精油可提高魚體的免疫能力，這與對(duì)虹鱒Oncorhynchusmykiss[28]和紅鼓魚Ocimumamericanum[29]的研究結(jié)果一致。

3.3 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚抗鰻弧菌感染能力的影響

Li等[30]研究表明，細(xì)菌感染魚體后會(huì)抑制補(bǔ)體替代途徑的活化，引起魚體產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成機(jī)體損傷；此外，攻毒試驗(yàn)還會(huì)造成動(dòng)物腸道促炎性細(xì)胞因子大量分泌，既消耗大量能量，又會(huì)引起腸道損傷[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在大菱鲆幼魚低魚粉飼料中添加植物精油或酶解魚溶漿與植物精油復(fù)配，均可提高魚體抗鰻弧菌感染能力，降低累積死亡率。其作用機(jī)理可能如下：第一，植物精油特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)易與細(xì)菌脂質(zhì)膜發(fā)生接觸從而穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)容物外溢，從而達(dá)到抗菌作用[32]；第二，植物精油可降低促炎性細(xì)胞的分泌，抑制白細(xì)胞的募集，減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的氧化損傷[33]。

3.4 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚消化能力的影響

Shi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在黃鱔Monopterusalbus配合飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的酶解魚溶漿替代魚粉，可顯著增加與黃鱔腸道消化相關(guān)的微生物數(shù)量，并顯著提高魚體消化酶活性，這與本試驗(yàn)中添加酶解魚溶漿顯著提高大菱鲆幼魚腸道胰蛋白酶活性的結(jié)果一致。其作用機(jī)理可能是酶解魚溶漿中富含小肽等物質(zhì)，可促進(jìn)腸道絨毛的生長(zhǎng)并完善胰腺外分泌功能，從而提高腸道胰蛋白酶活性[35]。但本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酶解魚溶漿并未顯著提高魚體腸道脂肪酶和淀粉酶活性。有研究表明，魚類脂肪酶和淀粉酶活力與飼料中的脂肪和淀粉含量相關(guān)[36]，這也可能是造成本試驗(yàn)中魚體腸道脂肪酶和淀粉酶活性無顯著性變化的原因之一。本試驗(yàn)中，與負(fù)對(duì)照組相比，飼料中添加植物精油顯著提高了幼魚胰蛋白酶活性，其機(jī)理可能是幼魚攝食精油后可刺激膽汁、消化道酶液分泌，提高內(nèi)源性消化酶活性，從而提高幼魚對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收能力[37]。有研究表明，動(dòng)物消化道中微生物數(shù)量和代謝與消化酶活性具有一定關(guān)系[38]。本試驗(yàn)中，在飼料中添加植物精油并未顯著影響幼魚腸道脂肪酶與淀粉酶活性，可能是飼料中添加精油提高了幼魚消化道中與蛋白質(zhì)降解有關(guān)的細(xì)菌數(shù)量，同時(shí)又降低了與淀粉酶和脂肪酶降解相關(guān)的細(xì)菌數(shù)量，其具體指標(biāo)分析與作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。此外，飼料中添加酶解魚溶漿和精油復(fù)配產(chǎn)生的交互作用，降低了胰蛋白酶活性，這可能是酶解魚溶漿的添加增強(qiáng)了精油的抗菌活性，影響了腸道菌群變化，從而影響了內(nèi)源性消化酶的分泌量[39]。

3.5 酶解魚溶漿和植物精油對(duì)幼魚肝臟TOR相關(guān)基因表達(dá)的影響

TOR是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，TOR信號(hào)通路是生物體對(duì)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境改變做出有效應(yīng)答的關(guān)鍵，也是調(diào)控生長(zhǎng)的重要通路[15]。雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(TORC1)是調(diào)控TOR信號(hào)通路下游真核啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白(4EBPs)的關(guān)鍵蛋白，而4EBPs是一個(gè)小分子的轉(zhuǎn)錄抑制劑[40]。當(dāng)TOR信號(hào)通路被激活，TORC1可磷酸化4EBPs的一些氨基酸位點(diǎn)，下調(diào)4EBPs基因表達(dá)水平，從而進(jìn)一步影響下游通路和促進(jìn)蛋白的合成[41]。本研究中發(fā)現(xiàn)，大菱鲆幼魚肝臟中TOR、4EBP1和4EBP2 mRNA表達(dá)量隨飼料的變化而變化，在負(fù)對(duì)照組幼魚肝臟中TOR、4EBP1和4EBP2基因表達(dá)量與正對(duì)照組無顯著性差異，這表明飼料中高植物蛋白替代魚粉對(duì)幼魚肝臟TOR信號(hào)通路并未產(chǎn)生顯著影響，這與對(duì)虹鱒[42]的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，在植物蛋白替代魚粉飼料中補(bǔ)充酶解魚溶漿可顯著上調(diào)肝臟TOR基因表達(dá)水平，下調(diào)4EBP1、4EBP2基因表達(dá)水平，表明飼料中添加酶解魚溶漿激活了幼魚肝臟TOR信號(hào)通路，其機(jī)理可能是酶解魚溶漿中的一些活性物質(zhì)可激活TOR信號(hào)通路[43]，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄，有利于幼魚的生長(zhǎng)，此結(jié)果與本試驗(yàn)中增重率結(jié)果也是一致的。目前，有關(guān)精油調(diào)控魚類TOR和4EBPs基因表達(dá)量的研究尚未見報(bào)道。本研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加精油及精油與酶解魚溶漿復(fù)配對(duì)大菱鲆幼魚肝臟TOR、4EBP1和4EBP2的基因表達(dá)量無顯著性影響。推測(cè)原因是精油作為植物提取物在不同動(dòng)物體內(nèi)代謝不同，其代謝產(chǎn)物不能激活TOR信號(hào)通路。

4 結(jié)論

1)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的低魚粉飼料中，添加1%的酶解魚溶漿投喂大菱鲆幼魚，可顯著提高其生長(zhǎng)性能、腸道胰蛋白酶活性和TOR基因表達(dá)量。

2)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的低魚粉飼料中，添加0.02%的植物精油投喂大菱鲆幼魚，可提高幼魚血清溶菌酶活性和抗鰻弧菌感染能力。

3)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的低魚粉飼料中，添加1%的酶解魚溶漿和0.02%的植物精油二者配伍投喂大菱鲆幼魚，對(duì)提高魚體增重率的效果要低于單一添加1%的酶解魚溶漿組，其相互作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。