劉恩慧，黃天晴，谷偉，王炳謙，張艷萍，李春雨，徐革鋒*

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所 農業(yè)農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.甘肅省水產研究所，甘肅 蘭州 730030；3.新疆天蘊有機農業(yè)有限公司，新疆 伊犁 835708)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP) 是宿主黏膜表面的一類重要防御因子，是機體自身免疫系統(tǒng)的重要組成部分。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽表現出對更多病原體(病毒、真菌和寄生蟲等) 的防御作用，具有無污染、無殘留特性，且在細菌中不易產生耐藥性[1-2]。近年來，隨著中國水產業(yè)不斷走向規(guī)模化和集約化，魚類人工養(yǎng)殖過程中水質污染、病害暴發(fā)、品質降低等問題嚴重制約了行業(yè)的健康發(fā)展[3]，另一方面，水產品中的藥物積累也將威脅消費者的健康?？咕淖鳛樗a動物自身免疫的關鍵組成部分，可保護魚類免受微生物病原體的危害[4-5]，將其作為抗生素的替代產品已成為行業(yè)研究的熱點。

肝臟表達抗菌肽(liver-expressed antimicrobial peptide，Leap) 是一類富含半胱氨酸的抗菌肽，其在肝臟中大量轉錄表達。2003年，Krause等[6-7]首次從人類的血液中分離出兩種亞型，即Leap-1和Leap-2，其分別包含8個和4個保守的半胱氨酸殘基。目前,相較于Leap-1，Leap-2的相關研究較少。在水產動物中，Leap-2已經在草魚Ctenopharyngodonidellus[8]、鯉Cyprinuscarpio[9]、褐鱒Salmotrutta[10]、虹鱒Oncorhynchusmykiss[11]、大黃魚Larimichthyscrocea[12]和卵形鯧鲹Trachinotusovatus[13]等多個物種中被分離鑒定?？咕腖eap-2通過破壞細菌膜結構的完整性從而發(fā)揮抗菌活性[14]，是免疫系統(tǒng)抵御微生物入侵的重要組成部分[15-16]。

烏蘇里白鮭CoregonusussuriensisBerg 是一種具有較高營養(yǎng)價值和經濟價值的冷水性魚類，主要分布于中國黑龍江流域、俄羅斯的西伯利亞和薩哈林等水系[17-19]。近年來，由于過度捕撈和棲息地破壞，烏蘇里白鮭的野生資源已嚴重衰退。1988年，該魚被列入《中國瀕危動物(魚類)紅皮書》名錄，定為“易?！奔壩锓N[19]。人工繁殖過程中研究人員發(fā)現，烏蘇里白鮭具有較強的病原抵抗能力，因此，針對該魚的非特異性免疫反應展開進一步研究，鑒定相關免疫因子的抗菌活性，可為該物種大規(guī)模養(yǎng)殖中的疾病防治提供重要參考。本研究中，通過對烏蘇里白鮭的肝臟表達抗菌肽Leap-2的克隆，探究了其在烏蘇里白鮭不同組織中的表達差異，并檢測了在嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和金黃色葡萄球菌感染后的Leap-2表達模式，以期為開發(fā)烏蘇里白鮭抗菌肽奠定基礎，并為了解烏蘇里白鮭對病原體的免疫應答機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用烏蘇里白鮭幼魚(體長為15.0 cm±1.5 cm、體質量為30.0 g± 1.2 g) 取自黑龍江水產研究所渤海冷水性魚類試驗站(牡丹江)，帶水充氣運回實驗室，飼養(yǎng)在循環(huán)控溫水族箱(180 cm×60 cm×50 cm)中。試驗期間，水溫為(18.0±0.2)℃，溶解氧為(7.8～10.0)mg/L，pH為7.2～7.5。日投喂2次，投餌量為魚體質量的2%，試驗前24 h停止投喂。

1.2 方法

1.2.1 烏蘇里白鮭Leap-2基因的克隆 基因克隆設計引物，參考虹鱒Oncorhynchusmykiss的Leap-2(GenBank：AY362187.1)，采用Primer 5.0 軟件設計特異性引物(表1)。使用1尾烏蘇里白鮭的肝臟組織cDNA作為克隆模板，通過PCR擴增Leap-2基因。PCR反應程序：94 ℃ 下預變性2 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，57 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行29個循環(huán)；最后再在72 ℃下延伸5 min。將PCR產物克隆到pMD-18T載體中進行測序(蘇州泓迅生物公司)。

表1 Leap-2基因克隆和表達引物

1.2.2 Leap-2氨基酸序列分析 對克隆得到的烏蘇里白鮭Leap-2基因編碼的氨基酸序列，通過NCBI BLAST軟件進行序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。采用DNAMAN 6.0軟件進行多個氨基酸序列的比對，采用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]，bootstrap值設定為1 000。采用在線分析軟件SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu,dk/services/SignalP/)預測序列信號肽，采用ExpASy(http://web.expasy.org/compute_pi/)預測蛋白的分子量和pI值，采用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進行保守結構域分析。

1.2.3 細菌攻毒試驗 將攻毒所用的健康魚分為4組，3個試驗組分別注射嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus，菌液培養(yǎng)至濃度為1×106CFU/mL時用于試驗魚腹腔的感染注射，每尾魚注射100 μL，對照組注射等體積的PBS溶液。每個試驗設置3個重復，每個重復6尾魚。在細菌攻毒后的0、2、4、8、12、24、48、72 h分別采集對照組和試驗組的性腺、腸、肝臟、心、皮膚、脾、鰓、腎和肌肉組織，無菌取樣，用液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 為分析烏蘇里白鮭Leap-2的表達，采用FastStart Universal SYBR?Green Master Mix(Rox)進行實時定量PCR。PCR反應條件：95 ℃下預變性10 min；95 ℃下循環(huán)變性15 s，60 ℃下退火復性30 s，共進行 40個兩步循環(huán)。以β-actin作為內參基因。引物是通過Primer Premier 5.0(Premier Biosoft Internation ) 設計，熒光定量PCR所用引物見表1。

1.2.5 Western blot檢測 從注射嗜水氣單胞菌0、4、12、24、48、72 h 6個時間點的肝臟組織中提取總蛋白，各組蛋白在SDS-PAGE緩沖液中煮沸20 min充分變性后，用質量分數為12%的SDS-PAGE凝膠分離，電泳結束后，將蛋白轉移到PVDF膜上，并通過Western印跡分析。以抗Leap-2(Ab199946，Abcam，1∶1 000)和β-微管蛋白(β-tubulin，yt4780，Immunoway，1∶10 000)為一抗，以山羊抗兔抗體IgG(1∶2 000) 為二抗。經Western印跡洗滌液PBST充分漂洗后，采用ECL試劑盒進行顯色，再用灰度分析軟件Image J對目的條帶進行分析，以β-tubulin作為內參，每個樣本設置3次重復。

1.3 數據分析

采用2-ΔΔCt法進行基因相對定量。試驗數據以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan法比較各組織間基因表達量的差異顯著性，采用T檢驗法比較攻毒后基因在各時間段的差異顯著性。顯著性水平設為0.05，極顯著性水平設為0.01。

2 結果與分析

2.1 Leap-2基因的克隆及序列分析

采用PCR方法從烏蘇里白鮭肝臟中克隆得到Leap-2的ORF區(qū)，將其命名為烏蘇里白鮭Leap-2 (GenBank：MZ 170050)。烏蘇里白鮭Leap-2的ORF區(qū)片段長度為276 bp，可編碼91個氨基酸，預測的蛋白相對分子質量為10 190，等電點pI為9.96。同其他物種相似，烏蘇里白鮭Leap-2氨基酸具有保守的氨基酸結構，N-端的26個氨基酸殘基為信號肽部分，隨后的24個氨基酸殘基為前體肽部分，C-端的41個氨基酸為成熟肽區(qū)域，其中包括4個高度保守的半胱氨酸殘基(圖1)。

利用MEGA軟件基于NJ算法構建烏蘇里白鮭Leap-2系統(tǒng)進化樹，結果顯示，烏蘇里白鮭與虹鱒、銀鮭Oncorhynchuskisutch、紅大麻哈魚O.nerka的親緣關系較近(圖2(a))。多序列比對顯示，烏蘇里白鮭的Leap-2氨基酸序列同銀鮭的一致性最高(96.7%)，與虹鱒和大西洋鮭Salmosalar的一致性分別為95.6%、94.51%。利用在線軟件MEME對10個物種的蛋白保守結構域進行分析，結果顯示，烏蘇里白鮭的Leap-2氨基酸序列與銀鮭、虹鱒、紅大馬哈魚、褐鱒和大西洋鮭的氨基酸序列結構一致(圖2(b))。

圖2 Leap-2氨基酸序列結構分析Fig.2 Structure analysis of Leap-2 amino acid sequence

箭頭指向4個保守的半胱氨酸殘基。The arrow shows the four conserved cysteine residues.圖1 烏蘇里白鮭與其他物種Leap-2氨基酸的多序列比對Fig.1 Multiple alignment of amion acid sequence of Leap-2 between Ussuri cisco Coregonus ussuriensis and other species

2.2 Leap-2基因在不同組織中的表達分析

熒光定量PCR結果顯示，Leap-2基因在烏蘇里白鮭的心、腸、肝臟、腎、肌肉、脾、皮膚、鰓、性腺9個組織中均有表達。以心臟組織為參照，計算烏蘇里白鮭Leap-2在其他各組織的相對表達量。其中，在肝臟中的相對表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是腸和脾，在肌肉中表達量最低，肝臟中表達量是肌肉中的106.12倍(圖3)。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。Note:The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences.圖3 Leap-2基因在烏蘇里白鮭不同組中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of the Leap-2 in different tissues of Ussuri cisco Coregonus ussuriensis

2.3 Leap-2基因在細菌感染后的組織表達變化

本研究中，選用革蘭氏陰性菌(嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)進行細菌攻毒試驗。從圖4可見：與對照組相比，注射嗜水氣單胞菌后4 h時，肝臟和脾中的Leap-2基因表達量極顯著上調(P<0.01)，分別為對照組的3.91、9.54倍，8 h時，皮膚、腎和腸中的表達量極顯著提升(P<0.01)，肝臟、鰓、脾、皮膚、腎、腸組織中的最高表達量分別為對照組的6.88、14.60、9.54、53.81、8.61、7.54倍；經殺鮭氣單胞菌感染后，Leap-2基因在6種組織中的表達量均表現出不同程度的上調，注射后24 h時肝臟中的表達量是對照組的16.48倍，4 h時脾中的表達量是對照組的13.76倍，隨后表達量呈下降趨勢，在48 h時恢復至對照組水平；與對照組相比，金黃色葡萄球菌的感染同樣誘導了Leap-2基因在6種組織中的表達上調，注射后2 h時，鰓和脾中的表達量顯著上調(P<0.05)，之后脾中的表達量呈持續(xù)上調，48 h時為對照組的19.20倍。

2.4 嗜水氣單胞菌感染后肝臟中Leap-2蛋白表達

為了進一步驗證Leap-2蛋白在烏蘇里白鮭應對病原物侵染時的免疫應答反應，本研究中提取了嗜水氣單胞菌注射后0、4、12、24、48、72 h烏蘇里白鮭肝臟中的Leap-2蛋白，以β-tubulin為內參，利用Western blot檢測Leap-2蛋白表達量的變化。結果顯示，在4、12、24 h時蛋白相對表達量明顯高于對照組，而48 h后蛋白表達量下調，該結果證實了細菌感染能夠誘導Leap-2蛋白在烏蘇里白鮭體內的表達上調(圖5)。

3 討論

3.1 Leap-2氨基酸序列分析

本研究中，分析了烏蘇里白鮭肝臟表達抗菌肽Leap-2氨基酸序列，同源性比對發(fā)現，其Leap-2與銀鮭的序列相似性較高，一致性可達96.7%。此外，同虹鱒、褐鱒、大麻哈魚的一致性均能達到90%以上，這說明Leap-2在鮭鱒魚類的進化中保持較高的保守性。王珊珊等[21]對人的Leap-2進行生物信息學分析發(fā)現，在不同物種中，Leap-2的信號肽和前體肽差異較大，但成熟肽相似度較高，推測成熟肽區(qū)域是蛋白質發(fā)揮作用的關鍵。此外，氨基酸結構分析顯示，烏蘇里白鮭Leap-2在成熟肽區(qū)域具有4個保守的半胱氨酸，這與文獻[22]報道的Leap-2的典型結構特點一致。研究表明，成熟肽區(qū)域的4個半胱氨酸殘基可能形成兩個二硫鍵，用于支撐β-發(fā)夾和螺旋結構，對核心結構的完整性和穩(wěn)定性具有重要作用[23]。根據Li等[13]對Leap-2氨基酸序列結構的分析，本研究中烏蘇里白鮭的Leap-2成熟肽4個半胱氨酸在C67與C78、C73與C83可能形成二硫鍵，這種二硫鍵形成方式與草魚和鯉中的預測結構一致[8-9]。推測烏蘇里白鮭的Leap-2可能與其他魚類具有相似的功能。

目前，在烏蘇里白鮭中僅發(fā)現了一種Leap-2，而在其他魚類中報道了該蛋白的多種類型。如虹鱒中分離出了Leap-2A、Leap-2B和Leap-2C 3種亞型[11]；鯉中鑒定得到的Leap-2A和Leap-2B 2種亞型[9]，西伯利亞鱘中鑒定出了Leap-2AB和Leap-2C 2種亞型，且Leap-2AB型表現出更強的抗菌活性[16]。結合NCBI序列比對結果，烏蘇里白鮭Leap-2與虹鱒的Leap-2B亞型(NP.001117937.1)同源性為95.6%，由此推測，本研究中所克隆的烏蘇里白鮭的Leap-2為B型。

*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對照組有極顯著性差異(P<0.01)。 *means significant difference compared with the control (P<0.05)；**means very significant difference compared with the control(P<0.01).圖4 細菌攻毒后烏蘇里白鮭Leap-2基因的組織表達變化Fig.4 Changes in tissue expression levels of Leap-2 gene in Ussuri cisco Coregonus ussuriensis with bacterial infection

3.2 Leap-2的組織表達模式及功能分析

前期研究發(fā)現，脊椎動物中的Leap-2基因表達模式有明顯差異。在哺乳動物中，人體內Leap-2基因主要在肝臟中被合成，分泌到血液中，且在尿液中也發(fā)現了Leap-2基因的代謝物[7]；豬體內Leap-2基因在肝臟、腸組織和腎臟中表達較高[24]。在魚類中，卵形鯧鲹Trachinotusovatus體內Leap-2基因在肝臟、脾和頭腎中的表達量相對較高[13]；鯉體內Leap-2基因在肝臟、頭腎和脾中大量表達[9]；草魚體內Leap-2基因在除血液外的其他組織中廣泛表達，且在肝臟中的表達量最高[8]；而虹鱒體內Leap-2基因僅在肝臟中顯著高表達[11]。本研究中，Leap-2基因在烏蘇里白鮭9個組織中均有表達，并具有組織表達豐度差異性。其中，肝臟中表達量最豐富，其次為腸和腎，在肌肉中表達量最低，這表明在非應激條件下，Leap-2基因在烏蘇里白鮭組織中有差異表達。綜上所述，不同物種中的Leap-2基因表達模式存在差異，但在免疫組織中均有較高表達，推測其在多個物種的免疫應答調控過程中發(fā)揮著關鍵作用。

*表示與0 h有顯著性差異(P<0.05)；**表示與0 h有極顯著性差異(P<0.01)。Note:*means significant difference compared with infection in 0 h (P<0.05)；**means very significant difference compared with infection in 0 h(P<0.01).圖5 嗜水氣單胞菌攻毒后烏蘇里白鮭肝臟中Leap-2蛋白的表達Fig.5 Leap-2 protein expression in liver of Ussuri cisco Coregonus ussuriensis after infection of Aeromonas hydrophila

3.3 細菌感染后Leap-2基因表達模式的變化

抗菌肽作為生物免疫系統(tǒng)分泌的一類具有抗菌活性的免疫活性物質，具有廣譜抗菌活性[25]。一般認為，革蘭氏陰性菌表面的脂多糖和革蘭氏陽性菌表面的磷壁酸帶負電荷，而帶正電荷的抗菌肽可以結合到帶負電荷的細菌細胞膜表面，從而破壞細菌細胞的完整結構，進而起到抑菌的作用[26-27]。為了探究烏蘇里白鮭的Leap-2基因在不同病原菌侵染下的表達模式，本研究中選擇了革蘭氏陰性菌(嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌)及革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)對烏蘇里白鮭進行免疫刺激。嗜水氣單胞菌是淡水、污水、淤泥及土壤中常見的細菌，也是引起淡水養(yǎng)殖生物爛鰓病和赤皮病的主要病原細菌[28]，在抗菌肽相關研究中，該菌作為外源刺激菌而被廣泛應用[29-30]。草魚經嗜水氣單胞菌感染后，在肝臟、脾、肌肉、皮膚、腎中Leap-2基因表達顯著上調[8]。而嗜水氣單胞菌感染團頭魴后，Leap-2基因在肝臟、脾、鰓、腦中的表達上調[31]。本研究中，嗜水氣單胞菌感染后，相對于對照組，Leap-2基因在肝臟、鰓、脾、皮膚、腎中的表達量均顯著提升。為進一步驗證該抗菌肽的免疫應答功能，本研究中利用Western印跡檢測了嗜水氣單胞菌感染后Leap-2在蛋白水平上的表達模式，研究結果證實了烏蘇里白鮭應對病原物入侵時，Leap-2在蛋白水平的表達上調，推測其在免疫反應中具有調控作用。

殺鮭氣單胞菌是鮭鱒魚類常見的致病菌之一[32]。研究發(fā)現，抗菌肽Leap-2對殺鮭氣單胞菌具有抑菌活性，在虹鱒中，殺鮭氣單胞菌攻毒后的2 d，腸和皮膚中的Leap-2基因表達上調[11]。本研究中，殺鮭氣單胞菌的感染誘導了Leap-2基因在烏蘇里白鮭中的顯著高表達，暗示烏蘇里白鮭Leap-2基因可能參與該致病菌引起的免疫調節(jié)反應。本研究中，利用金黃色葡萄球菌對烏蘇里白鮭進行感染，結果發(fā)現，烏蘇里白鮭Leap-2基因的表達在所調查的6種免疫器官中均得到不同程度的表達上調。前期研究表明，西伯利亞鱘的Leap-2基因對金黃色葡萄球菌有顯著的抗菌活性[16]。然而唇魚骨Hemibarbuslabeo的Leap-2基因對金黃色葡萄球菌則無明顯的抑制作用[33]。這些差異表達模式暗示Leap-2基因的誘導可能存在組織特異性和物種特異性。本研究中，在金黃色葡萄球菌攻毒后的2 h,鰓和脾中的Leap-2基因表達水平就表現出顯著升高，這可能是由于鰓和脾是魚類最主要的免疫器官所致。Leap-2基因的快速誘導表明，抗菌肽Leap-2可能在烏蘇里白鮭抵御多種細菌的早期防御中發(fā)揮一定的作用，但關于該肽的抗菌活性的確定，仍需要通過多肽的合成試驗進一步證明。

4 結論

1)本研究中克隆獲得了烏蘇里白鮭Leap-2基因，結合系統(tǒng)進化分析，推斷該分子為硬骨魚類Leap-2B型。

2)在烏蘇里白鮭的各個組織中均檢測到Leap-2基因，其中，肝臟中Leap-2基因的表達量最高。

3)經嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和金黃色葡萄球菌感染后，Leap-2基因在烏蘇里白鮭各組織中的表達量均有上調，這表明抗菌肽Leap-2參與烏蘇里白鮭應對外源干擾的免疫應答過程。